miRNA在重度子癇前期與正常妊娠胎盤組織中差異表達(dá)的研究

蔣濤濤，孫 波，沈 梅，董 潔，駱 琦

（深圳市第二人民醫(yī)院（安徽醫(yī)科大學(xué)深圳二院臨床學(xué)院），廣東深圳518035）

miRNA在重度子癇前期與正常妊娠胎盤組織中差異表達(dá)的研究

蔣濤濤，孫 波＊，沈 梅，董 潔，駱 琦

（深圳市第二人民醫(yī)院（安徽醫(yī)科大學(xué)深圳二院臨床學(xué)院），廣東深圳518035）

目的分別檢測重度子癇前期和正常妊娠婦女胎盤組織中微小RNA（miRNA）的表達(dá)情況，并初步探討miRNA的差異表達(dá)在重度子癇前期發(fā)生發(fā)展過程中的意義。方法 在我院住院剖宮產(chǎn)分娩的產(chǎn)婦中，選取5例重度子癇前期患者（實(shí)驗(yàn)組），5例正常妊娠孕婦（對照組），通過miRNA芯片技術(shù)檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組胎盤組織中miRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)共檢測了391個(gè)miRNA的表達(dá)譜，實(shí)驗(yàn)組與對照組組間比較，差異表達(dá)的miRNA共有81個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有80個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有1個(gè)，主要涉及細(xì)胞分化、血管重塑、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等多方面的功能。結(jié)論 重度子癇前期患者胎盤組織中miRNA的表達(dá)失調(diào)可能參與了重度子癇前期的發(fā)病及病理生理過程。

重度子癇前期；胎盤；miRNA；差異表達(dá)

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1707）

子癇前期（preeclampsia，PE）是以高血壓、蛋白尿等為主要臨床癥狀的妊娠期特有疾病，國外統(tǒng)計(jì)其發(fā)生率為2%～8%，與孕產(chǎn)婦妊娠期死亡、早產(chǎn)及新生兒死亡密切相關(guān)［1］。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但目前研究認(rèn)為胎盤的病理狀態(tài)與其相關(guān)［2，3］。微小RNA（m i R N A）屬于單鏈非編碼RNA，長約22個(gè)核苷酸，主要在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，胎盤組織中miRNA表達(dá)失調(diào)可能參與了重度子癇前期的發(fā)生，然而不同研究檢測出的差異表達(dá)的miRNA不盡相同［3－7］。為進(jìn)一步研究miRNA與重度子癇前期的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)比較sPE患者和正常妊娠孕婦的胎盤組織中miRNA的表達(dá)情況，并初步探討miRNA在重度子癇前期病理生理過程中的作用機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2014年3月至2014年5月期間在我院住院分娩的單胎初產(chǎn)婦共10例，其中5例sPE患者作為實(shí)驗(yàn)組，5例正常妊娠孕婦作為對照組，兩組在年齡和孕周方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），研究對象既往均無特殊病史，重度PE診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)茍文麗主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》第八版標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 胎盤娩出后5min內(nèi)，在胎盤母體面無鈣化區(qū)和出血點(diǎn)的部位采集數(shù)塊面積約1× 1cm的胎盤組織，并在生理鹽水中反復(fù)漂洗去除血污，干紗布吸除水分后及時(shí)放入液氮中，－80℃的冰箱保存。

1.2.2 樣本總RNA的提取質(zhì)檢和純化 按照Trizol法（北京博奧晶典）提取各個(gè)胎盤組織的總RNA，先予分光光度計(jì)定量，隨后通過甲醛變性膠電泳試驗(yàn)質(zhì)檢總RNA的質(zhì)量是否合格。對質(zhì)檢合格的總RNA使用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（AM1561）進(jìn)一步純化，并在純化后再次用分光光度計(jì)定量。

1.2.3 純化RNA的去磷酸化及標(biāo)記 取純化后的RNA 200ng，使用Agilent公司的miRNA Complete Labeling and Hyb Kit，主要步驟包括：①純化后的miRNA5’端磷酸基團(tuán)使用堿性磷酸酶CIP去除，此步為去磷酸化；②使用試劑盒中的T4RNA鏈接酶把Cyanine3－pCp連接到RNA3’端，完成標(biāo)記；③將濃縮抽干的miRNA放在雜交爐中過夜，完成雜交。備注：標(biāo)記外標(biāo)（Labeling spike－in）RNA和雜交外標(biāo)（Hyb spike－in）RNA作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的質(zhì)控。

1.2.4 芯片清洗及掃描 先將過夜雜交的芯片置于2×SSC和0.2%SDS的混合洗液中浸泡5min，甩干玻片，再置于0.2×SSC洗液浸泡5min，洗液溫度均控制在42℃左右，甩干玻片，將芯片置于使用Agilent芯片掃描儀（G2565CA）中掃描獲得雜交圖片。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 雜交圖片使用Agilent Feature Extraction（v10.7）軟件進(jìn)行分析后獲得原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)需經(jīng)Agilent GeneSpring軟件進(jìn)一步統(tǒng)一化處理，隨后即可用GeneSpring軟件對處理后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。FC表示兩組或兩個(gè)樣品之間的差異倍數(shù)；以2為底、Log FC的絕對值為冪得到的對數(shù)即為FC（abs），F(xiàn)C（abs）值越大，表示兩個(gè)樣品之間的差異越大。差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：FC（abs）＞2.0，且P＜0.05。

1.2.6 miRNA靶基因預(yù)測 通過序列查詢http：／／www.mirbase.org／index.shtml和靶基因預(yù)測http：／／www.umm.uni－h(huán)eidelberg.de／apps／zmf／mirwalk／index.html初步探究差異表達(dá)的miRNA在重度子癇前期病理生理過程中的調(diào)節(jié)作用。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)共檢測出81個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中僅miR－135b－5p表達(dá)下調(diào)，其余80個(gè)miRNA均表達(dá)上調(diào)，目前有16個(gè)miRNA已知其在染色體定位及靶基因，見表1，其中miR－188－5p、miR－362－3p和miR－532－3p位于同一基因簇Xp11.23上。

表1 實(shí)驗(yàn)組表達(dá)上調(diào)的miRNA

3 討論

miRNA在真核生物體內(nèi)普遍存在，其長度約22個(gè)核苷酸，作為獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)的單鏈的非編碼RNA，其本身不包含蛋白質(zhì)編碼區(qū)，而是通過與靶mRNA的3’UTR完全或不完全互補(bǔ)配對結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致其靶mRNA降解或抑制其蛋白質(zhì)翻譯，從而在細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮其基因調(diào)控作用。miRNA的生物學(xué)特性包括進(jìn)化高度保守性、組織特異性、表達(dá)時(shí)序性，且不同的miRNA可位于染色體的同一部位共同發(fā)揮調(diào)控作用即基因的簇集性［3，8］。目前miRNA的功能研究尚處于起始階段，絕大多數(shù)的miRNA的染色體定位及靶基因尚不清楚，僅初步開展了少部分的miRNA的功能研究。自Pineles等［4］首次發(fā)現(xiàn)miRNA在子癇前期和正常妊娠孕婦胎盤組織中的差異表達(dá)，國內(nèi)相繼開展了為數(shù)不多的相關(guān)研究［9－11］，但其檢測基因的范圍較小，基因的檢測方法各不相同，此外各研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)采用基因芯片技術(shù)，可以在短時(shí)間內(nèi)高通量、大規(guī)模的鑒定所有已知的391個(gè)miRNA的表達(dá)譜，并通過sPE組和對照組的組間比較，共檢測出81個(gè)差異表達(dá)的miRNA。

實(shí)驗(yàn)中miR－210表達(dá)上調(diào)，與既往研究相一致［4，9，12］。Enquobahrie DA等［12］發(fā)現(xiàn)miR－210主要參與內(nèi)皮細(xì)胞對低氧狀態(tài)的應(yīng)答、毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成以及VEGF趨化的細(xì)胞遷移等過程，其表達(dá)增量可能與胎盤低氧狀態(tài)有關(guān)。ZHANG等［13］發(fā)現(xiàn)妊娠早期的低氧環(huán)境誘導(dǎo)了NF－κB的活性上升，激活了miRNA－210／HOXA9及miRNA－210EFNA通路，進(jìn)而抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的正常分化和血管重塑，造成滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙、螺旋小動脈重鑄不足和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而參與PE的發(fā)生。綜合考慮sPE患者胎盤組織處于缺氧狀態(tài)，可以推測miR－210在重度子癇前期的病理過程中其起重要作用。miR－125a－3p位于19q13.3，其靶基因ANP是由21～35個(gè)氨基酸殘基組成的多活性肽，ANP的主要生理功能［14］是抑制炎性介質(zhì)和血管活性物質(zhì)的合成和釋放及免疫調(diào)節(jié)功能。正常妊娠時(shí)孕婦體內(nèi)的擴(kuò)血管活性物質(zhì)增加、縮血管物質(zhì)減少以維持子宮胎盤血流，國外研究發(fā)現(xiàn)PE患者的胎盤和血漿中NO水平降低而炎性介質(zhì)增加［15］，從而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血管痙攣；ANP可減少CD4（＋）、CD8（＋）細(xì)胞，增加CD4（－）、CD8（－）細(xì)胞，并促進(jìn)CD4（＋）向Th2和Th17細(xì)胞分化，外周血免疫相關(guān)基因的差異表達(dá)可能是sPE的發(fā)病原因之一［16］，重度子癇前期患者的胎盤及全身均存在著炎癥反應(yīng)的過度激活，影響子宮螺旋動脈的重鑄，并降低母體對胚胎和胎兒的免疫耐受。同時(shí)ANP通過減少腎素分泌、抑制醛固酮分泌、對抗血管緊張素和抗醛固酮，導(dǎo)致電解質(zhì)平衡的紊亂，而重度子癇前期患者有水鈉儲留、全身小血管痙攣、血壓增高等病理生理學(xué)變化。由此可推斷miR－125a－3p在PE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miR－134位于人類印記基因區(qū)（14q32.31），印記基因在遺傳學(xué)上不遵循孟德爾定律，只傳遞父系或母系單方的遺傳信息，另一系不傳遞或者傳遞后表達(dá)極弱，即印記基因呈親源依賴性的單等位基因表達(dá)。既往研究表明，印記基因可在人類及小鼠的胎盤生長、胎兒生長發(fā)育過程中發(fā)揮起調(diào)控作用［1720］。miR－134表達(dá)上調(diào)可能與胎盤的缺血缺氧病理狀態(tài)密切相關(guān)，因而參與sPE的病理生理過程。鑒于miRNA在sPE和正常妊娠孕婦胎盤組織中的明顯差異表達(dá)，國內(nèi)外有學(xué)者提出miRNA可以作為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的分子標(biāo)記物，在高危人群出現(xiàn)PE癥狀前有效的預(yù)測疾病的發(fā)生，用于sPE早期的預(yù)測［21，22］。

雖然目前僅有少部分miRNA的功能被初步闡明，絕大多數(shù)功能尚不清楚，但本實(shí)驗(yàn)中檢測出的部分差異表達(dá)的miRNA，其靶基因與重度子癇前期的病理生理學(xué)基礎(chǔ)密切相關(guān)，可以推斷miRNA的表達(dá)失調(diào)可能參與了重度子癇前期的發(fā)生發(fā)展過程，其具體的作用機(jī)制及途徑尚待進(jìn)一步研究。

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Study on differential expression of miRNA in placental tissue from severe preeclampsia and normal maternal

JIANG Tao－tao，SUN Bo，SHEN Mei，et al.
（The Second People＇s Hospital of Shenzhen，Anhui Medical University，Shenzhen518035，China）

ObjectiveTo detect differential expression of small RNA（miRNA）in placental tissue from severe pre－eclampsia and normal maternal，and to explore the pathogenesis of severe preeclampsia.Methods We chose 5cases of severe preeclampsia patients（experimental group）and 5cases of normal pregnancy pregnant women（control group）among those delivery in hospital.And the miRNA expression profile was studied using miRNA microarray analysis.Results Eighty－one miRNAs were found to be dysregulated in placentas of sPE patients among the 391identified genes.Eighty miRNAs were overexpressed and only one miRNA was underexpressed.These differential expression of miRNA may be related to cell differentiation，vascular remodeling，endocrine regulation，and so on.Conclusion The dysregulation of miRNA in severe preeclamptic placental tissue is closely associated with the the pathophysiological process of sPE.

Severe preeclampsia；Placenta；miRNA；differential expression

R714.2

A

2015－01－12）

1007－4287（2015）10－1707－04

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JCYJ20130401113027619）

＊通訊作者