系統性紅斑狼瘡患者外周血CXCL13及其受體CXCR5表達水平的研究

謝聞悅，聶李平，楊媛慧

（北京大學深圳醫院檢驗科，廣東深圳518036）

系統性紅斑狼瘡患者外周血CXCL13及其受體CXCR5表達水平的研究

謝聞悅，聶李平，楊媛慧

（北京大學深圳醫院檢驗科，廣東深圳518036）

目的檢測系統性紅斑狼瘡（SLE）患者血清趨化因子CXCL13水平及其受體CXCR5在外周血B細胞、濾泡輔助T細胞（TFH）上的表達，分析CXCL13、TFH細胞水平與疾病活動的相關性，探討CXCL13及CXCR5受體在SLE發病機制中的可能作用。方法 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測58例SLE患者血漿CXCL13水平，以流式細胞術檢測24例SLE患者外周血中CXCR5在CD19＋B細胞、TFH細胞上的表達水平。結果 ①血清CXCL13SLE患者組為365.96±216.02（pg／ml），高于健康對照組145.66±207.25（pg／ml）（P＜0.01）與SLE緩解組167.19±145.37（pg／ml）；CXCL13水平與SLE患者的SLEDAI評分、抗核抗體滴度呈正相關（P＜0.05）。②SLE患者B細胞CXCR5的表達率為79.03±20.59%，顯著低于健康對照組94.25±4.52%，P＜0.05。③：SLE活動組TFH細胞水平（%）15.36±7.01高于健康對照組8.92±5.11%，P＜0.05；TFH細胞水平與患者的SLEDAI評分呈正相關（P＜0.05），與C3、dsDNA無相關性（均P＞0.05）。結論 SLE患者外周血CXCL13及表達其受體CXCR5的TFH細胞水平增高，并與病情的活動性相關，提示CXCL13有可能積極參與至SLE的發病機制中，并更有可能為SLE的治療提供新的靶點。

紅斑狼瘡；系統性；趨化因子CXCL13；受體CXCR5

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1689）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是自身免疫病的原型，發病機制尚不明確，高度活化的T、B淋巴細胞被認為是其主要的免疫特征之一。CXCL13又名B淋巴細胞趨化因子，屬于CXC趨化因子家族，與其受體CXCR5一同在B淋巴細胞遷移、尋靶和誘導次級淋巴組織中生發中心的形成中有著重要作用［1］。研究顯示，CXCR5不僅表達于B細胞表面，還是濾泡輔助T細胞（TFH）表面的重要標志。這決定了TFH細胞的定位和功能，在淋巴濾泡中CXCL13的趨化下，被募集到淋巴濾泡并與B細胞共定位且輔助B細胞的增殖與活化，促進Ig同型轉換和漿細胞分化［2，3］。本文通過測定SLE患者血清CXCL13及其CXCR5在外周血B細胞、TFH細胞上的表達水平，探討CXCL13及其受體CXCR5在SLE發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 血清CXCL13檢測的研究對象 收集2011年11月至2012年10月于我院風濕免疫科住院SLE患者58例，所有患者均符合1982年美國風濕病學院（ACR）修訂的SLE診斷標準。按SLE疾病活動指數（SLEDAI）分為活動組（≥5分）和穩定組（＜5分）。活動組23例，男性1例，女性22例，平均（30±7）歲；緩解組35例，男性3例，女性32例，平均年齡（33±10）歲。健康對照組22例，男性3例，女性19例，平均（26±5）歲，無自身免疫性疾病史。

1.1.2 外周血細胞CXCR5表達的研究對象 選取2011年11月至2012年5月于我院風濕免疫科住院SLE患者24例，男2例，女22例，平均年齡（30±13）歲。所有患者均符合1982年美國風濕病學院（ACR）修訂的SLE診斷標準。健康對照組15例，男4例，女11例，平均年齡（31±12）歲，無自身免疫性疾病史。檢測外周血CD4＋CXCR5＋T細胞（TFH）水平以及CXCR5＋在B細胞（CD19＋）上的表達。

1.2 主要儀器和試劑 FITC－CD4單抗、ECD－CD3單抗和ECD－CD19單抗購自美國Beckman公司，PE－CXCR5單抗購自美國R＆D公司，流式細胞儀型號為美國Beckman公司EPICS XL－4。CXCL13水平檢測試劑盒購自美國R＆D公司。抗核抗體（ANA）檢測試劑盒、雙鏈DN A（dsDNA）抗體試劑盒為歐蒙醫學實驗診斷股份公司產品；、補體C3試劑與儀器均為美國Beckman公司生產。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞術檢測TFH細胞、B細胞表面CXCR5表達水平 取EDTA抗凝外周血標本50 μl 3管，分別加入陰性對照抗體、CD5－FITC／CXCR5－PE／CD19－ECD抗體和CD4－FITC／CXCR5－PE／CD3－ECD抗體，每種抗體各加10μl。4℃避光孵育30min后，加入250μl溶血劑室溫放置10 min，鞘液離心洗滌去上清后，500μl鞘液重懸，用流式細胞儀按常規操作進行檢測，所得數據用其配套軟件分析。

1.3.2 CXCL13、dsDNA水平檢測采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA），具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 ANA檢測采用間接熒光免疫法，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，結果判斷為顯微鏡下觀察熒光模型及滴度，以滴度大于或者等于1∶100為ANA檢測陽性。補體C3采用透射比濁法檢測。

1.4 統計學處理 數據采用SPSS19.0統計軟件進行分析，計數資料以百分率（%）表示，計量資料以均數±標準差（x—±s）表示，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CXCL13的水平及CXCL13與實驗室指標間的相關性 SLE患者活動組CXCL13水平為365.96±216.02（pg／ml），高于健康對照組145.66 ±207.25（pg／ml）（P＜0.01）；SLE穩定組CXCL13水平為167.19±145.37（pg／ml），與健康對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）見圖1。進一步分析SLE患者血清CXCL13水平，發現11（19%）例狼瘡腎炎患者的CXCL13水平為329.8±236.1（pg／ml），高于47例非狼瘡腎炎患者201.98± 172.03（pg／ml）；對58例SLE患者CXCL13水平患者的SLEDA I評分、抗核抗體（ANA）、雙鏈DNA抗體（dsDNA）、補體C3水平的相關性進行統計學分析。結果表明，CXCL13水平與患者的SLEDAI評分、抗核抗體滴度呈正相關（P＜0.05），與C3、dsDAN無相關性（均P＞0.05），見表1。

表1 CXCL13與SLEDAI、dsDAN、ANA、C3的相關性

2.2 CXCR5在外周血TFH細胞、B細胞上的表達2.2.1 CXCR5在B細胞上的表達 SLE患者B細胞CXCR5的表達率（%）為79.03±20.59，顯著低于健康對照組B細胞CXCR5的表達率94.25± 4.52，P＜0.05，結果見圖2。

2.2.2 外周血CD4＋CXCR5＋T細胞（TFH）的水平 SLE患者組TFH細胞水平（%）15.36±7.01，健康對照組為8.92±5.11，P＜0.05（見圖3）；TFH與患者的SLEDA I評分呈正相關（P＜0.05），與C3、dsDNA無相關性（均P＞0.05），見表2。

圖1 SLE組與正常對照組間CXCL13的比較（SLE活動組與正常對照組，P＜0.05）

圖2 SLE組與正常對照組間B細胞上CXCR5的表達（SLE組與正常對照組，P＜0.05）

圖3 外周血SLE組與正常對照組間TFH細胞水平的比較（SLE組與正常對照組，P＜0.05）

表2 TFH細胞水平與SLEDAI、dsDAN、C3的相關性

3 討論

系統性紅斑狼瘡（SLE）發病機制復雜，為多種因素相互作用，導致免疫紊亂，B細胞異常被認為是SLE發病的中心環節，可能參與狼瘡疾病的整個過程，導致疾病的發生［4］。趨化因子CXCL13在吸引B細胞遷移，有效誘導外周器官二級淋巴組織的形成中起著重要作用［1，5］。在多個以B細胞異常增生與活化為特征的疾病研究中發現的CXCL13升高與疾病的活動性相關，推測CXCL13可能與疾病的發病機理相關［6，7］。Ishikawa等是最早將SLE與CXCL13聯系一起的，他們發現高齡狼瘡腎炎BWF1小鼠的胸腺和腎臟中的CXCL13表達顯著增加，認為CXCL13可誘導受損器官中異位淋巴組織的形成以及炎性細胞的聚集［8］。本研究顯示SLE活動組病人的CXCL13明顯高于健康組與SLE穩定組，并與疾病活動指數SLEDAI呈正相關，這與Schiffer和Ezzat等人結果相一致［9，10］，說明CXCL13與SLE的疾病活動相關，可作為SLE疾病活動期的穩定標志。然而Schiffer等人發現CXCL13在炎癥反應尤其是敗血癥中會顯著升高，故而提示CXCL13不能用于區分重度的炎癥反應和自身免疫病活動期［11］。狼瘡腎炎（LN）是SLE常見而嚴重的并發癥，腎內B細胞的增殖和聚集導致腎臟的炎癥與疾病的進展，而B細胞的聚集區域可出現CXCL13水平的升高和CXCL13mRNA表達的增強［12］。Ezzat等人報道LN患兒血清CXCL13水平較無腎臟疾病的SLE患兒顯著升高，且與腎臟的損害程度相關［10］。進一步分析本研究結果發現，11（19%）例狼瘡腎炎患者CXCL13水平遠高于非狼瘡腎炎患者，這提示CXCL13還有可能成為腎臟損傷程度的指標。Worthmann的研究結果進一步發現，CXCL13表達定位于腎小球，誘導炎性因子的產生，參與腎小球腎炎的發病機理，推測CXCL13作為治療靶點的可能［12］。

B細胞異常被認為是SLE發病的中心環節，活化的B細胞在T細胞的輔助下產生致病性的自身抗體導致組織損傷，并通過分泌細胞因子參與免疫調節，使自身免疫狀態持續存在。CXCR5作為趨化因子CXCL13的特異性受體，主要分布在所有的外周成熟B細胞表面。我們的結果顯示，SLE病人組B細胞上的CXCR5表達明顯低于健康組，這可能與SLE患者CXCL13水平顯著升高，持續性誘導外周血表達CXCR5＋B細胞歸巢進入淋巴濾泡，進而導致B細胞上CXCR5的表達下降相關［13］。Maiko等人推測，丟失CXCR5的病理性B細胞借助濾泡輔助T細胞（TFH）的介導產生病理性自身抗體，獲得記憶B細胞的效應功能參與到SLE的疾病進程中［14］。

TFH是目前研究的熱點之一，也是最主要的效應輔助T細胞，主要定位于淋巴器官中的濾泡區。其表面除標志性表達趨化因子受體CXCR5，還表達BCL－6，PD－1，ICOS等表面分子。主要功能是在CXCL13的誘導下遷移進入生發中心與B細胞接觸，輔助進行B細胞選擇和協助其分化為記憶細胞和漿細胞，進而參與SLE的發病機制中。多個研究發現SLE患者外周血CD4＋CXCR5＋的TFH細胞比例升高，并與SLEDAI、漿細胞、自身抗體dsDNA等指標顯著相關［15，16］。Chio［15］等人認為TFH與疾病的活動性相關表明T－B細間相互作用的異常平衡是參與SLE的發病機理的關鍵。Xu［16］等人發現CD4＋CXCR5＋T細胞較CD4＋CXCR5－T細胞能幫助B細胞產生更多IgG，以抗CD40L阻斷T－B細胞間相互作用可降低抗體的產生。與文獻報道相同的是我們也發現SLE患者外周血TFH比例顯著高于健康對照組，并SLEDAI評分呈正相關，但與dsDNA等指標無相關性。我們認為SLE是高度異質性疾病，臨床表現多種多樣，即使是發病年齡不同的患者，臨床特征和發病機制也可能存在差異。如果研究中選擇SLE患者樣本有差異，或者還存在藥物治療、感染等混雜因素的影響，就可能出現研究偏差，繼而造成研究結果的差異。

吳鳳霞［17］等人報道CXCL13水平與環磷酰胺及羥氯喹等免疫抑制劑用量呈顯著性正相關，抗－CXCL13治療可抑制膠原誘導的關節炎及降低淋巴組織的濾泡反應［18］。俞寧［19］等發現經地塞米松治療一周后，SLE病人的TFH細胞可逐漸降低，Meraouna［20］發現糖皮質激素可以抑制CXCL13的產生進而影響生發中心B細胞的數量和遷移，減少生發中心的形成，CXCL13有可能為治療提供新的靶向分子。

綜上所述，SLE患者外周血CXCL13及表達其受體CXCR5的TFH細胞水平增高，并與病情的活動性相關，這些都提示CXCL13有可能積極參與至SLE的發病機制中，并更有可能為SLE的治療提供新的靶點。

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The study of circulating CXCL13level and expression of its receptor CXCR5 with system lupus erythematosus

XIE Wen－yue，NIE Li－ping，YANG Yuan－hui.
（Department of Clinical Laboratory，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen518036，China）

ObjectiveTo detect the s levels of chemokine CXCL13and the expression of receptor CXCR5on CD19＋B cell and CD4＋Th cells in patients with systemic lupus erythematosus（SLE），to access the relationship between CXCL13、TFH and SLE disease activity.Methods The serum levels of CXCL13were measured by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）in 58patients with SLE and frequencies of CD19＋CXCR5Bcells and CD4CXCR5Tcell w ere analyzed b y flow－cytometry in 24patients with SLE.Results ①Serum CXCL13concentration was significantly higher in SLE active patients than inactive SLE group and NC group（P＜0.05）；Increase in CXCL13concentration correlated positively and significantly with SLEDAI，Anti－nuclear antibody titers（all P＜0.05）.②the frequencies of CXCR5on CD19＋B cell were significantly down regulated in SLE patients whiling comparing with NC group.③The percentage of CXCR5in CD4＋T cells was increased jn patients with SLE compared with healthy controls，P＜0.05.There were positive co－relationship between TFH and SLEDAI.Conclusion Elevated CXCL13level and increased frequency of circulating Tfh cells in SLE patients are associated with disease activity，indicating CXCL13and its receptor CXCR5may play an important role in the pathogenesis of SLE.

Lupus erythematosus；systemic；chemohine CXCL13；receptor CXCR5

R593.2

A

謝聞悅（1974－），女，碩士，主管技師，主要從事臨床免疫學工作。

2014－12－05）

1007－4287（2015）10－1689－04

深圳市科技計劃項目（201203031）