實(shí)驗(yàn)性APS小鼠經(jīng)口服β2糖蛋白后Th17細(xì)胞及RORγt mRNA表達(dá)變化

谷文靜，熊 斌，譚 巖，方艷秋＊，付 嘉

（1.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，天津300071；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院外科總論教研室，山東濟(jì)寧272067；3.吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，吉林長(zhǎng)春130021；4.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院免疫教研室，山東濟(jì)寧272067）

實(shí)驗(yàn)性APS小鼠經(jīng)口服β2糖蛋白后Th17細(xì)胞及RORγt mRNA表達(dá)變化

谷文靜1，熊 斌2，譚 巖3，方艷秋3＊，付 嘉4

（1.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，天津300071；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院外科總論教研室，山東濟(jì)寧272067；3.吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，吉林長(zhǎng)春130021；4.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院免疫教研室，山東濟(jì)寧272067）

抗磷脂抗體綜合征（Antiphospholipid antibody syndrome，APS）是一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，該病以反復(fù)發(fā)作的血栓和流產(chǎn)為主要特征和臨床表現(xiàn)，患者血清中可檢出持續(xù)存在抗磷脂抗體（APA）［1］。APS的確切病因目前還不很清楚，除遺傳因素和微生物感染參與疾病發(fā)生外，大量證據(jù)顯示，自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞參與APS的發(fā)病，并輔助自身反應(yīng)性B細(xì)胞活化產(chǎn)生抗磷脂抗體（APA），致炎因子TF、TNF－α、IL－6、ET－1等大量生成，內(nèi)皮細(xì)胞和血小板活化，凝血因子和補(bǔ)體激活等，導(dǎo)致APS血栓形成、血管炎癥。鑒于致炎因子IL－6在誘導(dǎo)CD4＋細(xì)胞向Th17分化中發(fā)揮重要作用；激活的補(bǔ)體可通過(guò)TLR4信號(hào)途徑促進(jìn)Th17的發(fā)育；同時(shí)來(lái)自SLE的Th17分泌的IL－17A可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM－1等黏附分子，促進(jìn)SLE血管炎癥［2－6］。故而我們推測(cè)Th17在APS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

我們前期工作顯示CD4＋CD25＋Treg參與實(shí)驗(yàn)性APS（EAPS）的口服耐受機(jī)制。本研究采用RT－PCR檢測(cè)EAPS小鼠PBMC中轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA的表達(dá)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EAPS小鼠PBMC中Th17細(xì)胞的百分率；以期進(jìn)一步了解Th17在EAPS發(fā)病機(jī)制和口服耐受中所發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 抗小鼠FITC anti－CD4、PE－－anti－IL－17購(gòu)自美國(guó)BD公司及同型對(duì)照γ1／γ2購(gòu)于美國(guó)BD公司；離子霉素（Ionomycin）、乙酸肉豆蔻佛波醇（phorbo lm yristic acetate，PMA）及布雷菲德菌素（brefeldin A，BFA）購(gòu)自Sigma公司。CO2培養(yǎng)箱（GBB16Heraus，German）。流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD公司，美國(guó)）；低溫高速離心機(jī)（Beckman，USA）；RPMI 1640培養(yǎng)液和Hank s＇液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。PCR引物由上海生工生物公司合成。dNTP、Taq DNA聚合酶、TRIZOL、MML－V逆轉(zhuǎn)錄酶等購(gòu)于晶美生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8－10周齡雌性BALB／c小鼠，購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無(wú)特定病原菌條件下飼養(yǎng)。

1.3 人β2糖蛋白1的重組表達(dá) 見(jiàn)文獻(xiàn)［7］。

1.4 分組 將小鼠分為3組：正常對(duì)照組、EAPS模型組及口服耐受組。口服耐受組及EAPS模型組小鼠在模型建立前10天，分別以0.5mg rhβ2GP1／PBS灌胃，隔天灌胃1次共5次。

1.5 免疫方案——EAPS模型的建立及各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè) 見(jiàn)文獻(xiàn)［8］。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠PBMC CD4＋I(xiàn)L－17＋Th17細(xì)胞 用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整外周血單個(gè)核細(xì)胞濃度為1×109／L，用24孔板進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加入200μl的細(xì)胞懸液，含PMA（25μg／L）、Ionomycin（1mg／L）和BFA（10mg／L），5%CO2，37℃孵育培養(yǎng)5h，間隔30分鐘搖勻一次。取出移至試管中，加10μl FITC anti－CD4，室溫避光孵育30 min。加100μl固定液孵育15min，PBS洗滌后加100μl破膜液，同時(shí)加入PE－－anti－IL－17及同型對(duì)照，孵育30min。以含1%多聚甲醛的PBS避光固定，待上機(jī)檢測(cè)。在FSC－SSC散點(diǎn)圖上圈定淋巴細(xì)胞群，用CD4和SSC射門(mén)。選擇CD4＋細(xì)胞分析IL－17的表達(dá)，收集細(xì)胞數(shù)10 000／管進(jìn)行分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用Cell Quest分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 RT－PCR檢測(cè)小鼠PBMC中RORγt mRNA表達(dá) Trizol試劑提取總mRNA，在42℃進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR體系中加入2.5UTaqDNA多聚酶，2.5 mM dNTPs，0.25μM引物，引物分別為RORγt（5’－CTGAGGGGCTGTCAAAGTG－3’）和（5’－AAG GCT GGG TGA AGG G－3’），或GAPDH（5’－TCCA CCACC CTG TT GCTGTA－3’）和（5’－ACCACAGTCC ATGCC ATCAC－3’）。94℃40s，56℃60s，72℃60s。94℃90s，72℃7min。共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像分析。檢測(cè)產(chǎn)物灰度值與內(nèi)參的灰度值的比值表示RORγt mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠PBMC中CD4＋I(xiàn)L－17＋Th17細(xì)胞百分率變化 在三組小鼠免疫后第4、8、12、16、20周檢測(cè)三組小鼠的Th17細(xì)胞在CD4＋T細(xì)胞百分率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組在第4周開(kāi)始逐漸升高，在第8、12、16周與正常對(duì)照組均具有顯著差異性（P＜0.05）。耐受組在各時(shí)間段與對(duì)照組相比，差異未見(jiàn)顯著性（P＞0.05）（圖1）。

2.2 小鼠PBMC中轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá)的變化三組小鼠免疫后4、8、12、16、20周RORγt mRNA表達(dá)變化（如圖2），自第4周，模型組小鼠表達(dá)水平逐漸升高，第8、12、16、20周差異顯著（P＜0.05）；耐受組小鼠PBMC中RORγt基因表達(dá)在各時(shí)間段明顯低于模型組（P＜0.05），與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)口服耐受組、模型組及對(duì)照組小鼠PBMC中CD4＋I(xiàn)L－17＋T細(xì)胞百分率變化

圖2 RT－PCR檢測(cè)口服耐受組、模型組及對(duì)照組小鼠PBMC中RORγt mRNA表達(dá)變化

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，很多學(xué)者們認(rèn)為T(mén)h1細(xì)胞介導(dǎo)了多種自身免疫性疾病的發(fā)生。然而，Langrish等研究發(fā)現(xiàn)：在基因敲除動(dòng)物模型中，缺失能產(chǎn)生IL－17的（IL－17＋）T細(xì)胞可以使實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的發(fā)病受到抑制。Park等研究也發(fā)現(xiàn)：清除或中和EAE動(dòng)物模型的Th1型細(xì)胞因子（IFN－γ或IL－12），并不能預(yù)防或減輕自身免疫性疾病的發(fā)生和進(jìn)展。從而使人們認(rèn)識(shí)到在此情況下，是IL－17＋T細(xì)胞誘導(dǎo)了自身免疫病的發(fā)生和進(jìn)展。因此將這種能分泌IL－17的T淋巴細(xì)胞命名為一個(gè)新的亞群——Th17細(xì)胞。此后，隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明Th17細(xì)胞與自身免疫性疾病之間存在著密切的關(guān)系［9－12］。現(xiàn)已知道，IL－17表面表達(dá)IL－6R、IL－21R、CCR6、IL－23R、IL－1R等炎癥相關(guān)受體，核內(nèi)表達(dá)維甲酸相關(guān)的孤兒核受體（RORγt）和STAT3。其中，RORγt是調(diào)控Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并可誘導(dǎo)IL－17的分泌，也是Th17的特異性標(biāo)志［13－15］。

研究表明，口服自身抗原可誘導(dǎo)多種實(shí)驗(yàn)性自身免疫病的耐受，這可以為特異性治療自身免疫性疾病提供新的途徑和思路。口服耐受的機(jī)制涉及免疫無(wú)能和缺失、主動(dòng)抑制、旁路抑制等。通常高劑量抗原可誘導(dǎo)自身反應(yīng)T細(xì)胞的克隆刪除和克隆無(wú)能，低劑量可誘導(dǎo)主動(dòng)抑制。我們的前期工作表明，CD4＋CD25＋Treg參與EAPS的發(fā)病和口服耐受機(jī)制［8］。

Th17與Treg細(xì)胞都來(lái)源于初始CD4＋T細(xì)胞，兩者的功能和分化過(guò)程密切相關(guān)，在正常情況下兩者保持平衡［16］。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病時(shí)，初始T細(xì)胞的分化格局發(fā)生變化，Th17細(xì)胞分化增強(qiáng)，導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)損傷機(jī)體。研究發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性硬化癥（MS）、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、重癥肌無(wú)力（MG）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）等自身免疫病患者及動(dòng)物模型中均存在Th17數(shù)量和功能的改變［9－11，17］。故而我們推測(cè)Th17細(xì)胞在APS發(fā)病機(jī)制和口服耐受中發(fā)揮作用。

本研究表明，自免疫第4周，自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞增殖活化，模型組小鼠PBMC中CD4＋I(xiàn)L－17＋Th17細(xì)胞開(kāi)始升高，隨著疾病進(jìn)展，CD4＋I(xiàn)L－17＋Th17細(xì)胞頻率繼續(xù)升高（P＜0.05），提示自身免疫反應(yīng)產(chǎn)生的大量致炎因子如TNF－α［3］、IL－6［6］等可能促進(jìn)了Th17細(xì)胞的分化。而耐受組在各時(shí)間段與對(duì)照組相比未見(jiàn)顯著差異（P＞0.05），顯示口服耐受可能對(duì)Th17細(xì)胞的發(fā)生、分化或分布產(chǎn)生影響。隨著CD4＋I(xiàn)L－17＋Th17細(xì)胞頻率升高，模型組小鼠PBMC中轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)水平也相應(yīng)升高（P＜0.05），耐受組小鼠PBMC中RORγt基因表達(dá)在各時(shí)間段均明顯低于模型組（P＜0.05），與正常對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。鑒于RORγt是調(diào)控Th17分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，我們的研究結(jié)果提示APS進(jìn)展與Th17的過(guò)度分化有密切關(guān)系；口服耐受可通過(guò)調(diào)節(jié)Th17的分化發(fā)揮作用。

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谷文靜（1982－），女，在讀碩士，主要從事免疫學(xué)、分子生物學(xué)方面的研究。

2014－08－16）

1007－4287（2015）10－1639－03

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助課題（ZR2010CL017、ZR2014HL023）；濟(jì)寧市科技局項(xiàng)目資助課題；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目資助課題

＊通訊作者