DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究

趙 鑫，常 穎，劉玉俠，盧衛(wèi)平，王 寶，王 哲，于 鴻，王啟文，王 斌＊

DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究

趙 鑫1，常 穎1，劉玉俠2，盧衛(wèi)平1，王 寶1，王 哲1，于 鴻2，王啟文1，王 斌1＊

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所）

目的探討DC（dendritic cells）、CIK（cytokine－induced killer cells）聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549的殺傷活性的影響，并與單獨(dú)CIK對(duì)A549殺傷活性進(jìn)行比較，為腫瘤生物治療提供有效方法。方法 分別培養(yǎng)DC、CIK細(xì)胞，經(jīng)鑒定后進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，聯(lián)合培養(yǎng)3天后，對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行殺傷活性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)DC聯(lián)合CIK及單獨(dú)CIK對(duì)A549的殺傷活性，同時(shí)用流式細(xì)胞檢測(cè)DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞及單獨(dú)CIK細(xì)胞中淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)。結(jié)果 DC聯(lián)合CIK對(duì)A549的殺傷活性為88.38%，CIK對(duì)A549的殺傷活性為66.24%，兩者對(duì)A549的殺傷活性比較有顯著差異（P＜0.01）；DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞亞群中的CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋的數(shù)量均高于CIK細(xì)胞。結(jié)論 DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)肺癌細(xì)胞A549的殺傷活性明顯高于單獨(dú)CIK對(duì)A549的殺傷活性（P＜0.01）；抗腫瘤淋巴細(xì)胞（CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋）數(shù)量也明顯高于CIK細(xì)胞。

樹突狀細(xì)胞；CIK細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞亞群；殺傷活性

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1636）

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是人體內(nèi)抗原遞呈能力極強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，它可以通過捕獲，加工腫瘤抗原，并將其遞呈給T淋巴細(xì)胞，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)主動(dòng)攻擊腫瘤。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine－induced killer cell，CIK）是經(jīng)多種細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)的以CD3＋CD56＋細(xì)胞為主的，具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性的廣譜抗腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)利用DC、CIK細(xì)胞各自的抗腫瘤特性將DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)，檢測(cè)其體外對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷活性，并與單純CIK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷活性進(jìn)行比較，同時(shí)檢測(cè)它們的淋巴細(xì)胞亞群產(chǎn)生的數(shù)量，分析T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量與殺傷活性的關(guān)系，為腫瘤病人生物治療的選擇提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

淋巴細(xì)胞分離液：購(gòu)于天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司；GM－CSF，TNF－α，IL－4：購(gòu)于Peprotech公司；IMDM培養(yǎng)基：GIBCO公司；胎牛血清：購(gòu)于天津康源公司；IL－2：購(gòu)于北京四環(huán)生物制藥有限公司；anti－CD3Ab：Biolegend公司。anti－h(huán)unman CD3－FITC，anti－h(huán)unman CD16、CD56－PE，購(gòu)自BD公司；IFN－γ：購(gòu)于上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司；CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋熒光標(biāo)記單克隆抗體：購(gòu)自美國(guó)BECKMAN COULTER公司；CCK8：購(gòu)于上海同仁化學(xué)研究所。

1.2 肺腺癌細(xì)胞株A549

吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

低溫高速離心機(jī)，SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，芬蘭雷勃公司；流式細(xì)胞儀，BD公司。

1.4 樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)

1.4.1 分離人外周血單核細(xì)胞 用Ficoll梯度密度離心法分離人外周血單核細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1× 106／ml，加到含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，放入250ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.4.2 以上分離的單核細(xì)胞培養(yǎng)1天后，加入GM－CSF（100ng／ml），IL－4（50ng／ml），TNF－α（10 ng／ml）等細(xì)胞因子，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天半量換液并補(bǔ)加細(xì)胞因子，誘導(dǎo)DC生成，7天后進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定

1.5 CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)

將以上提取的外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)1天后，加入IFN－r anti－h(huán)umanCD3、IL－1a、IL－2等細(xì)胞因子，培養(yǎng)3天后分瓶，同時(shí)補(bǔ)加IL－2，7天后進(jìn)行CIK表型鑒定。

1.6 DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)

將以上經(jīng)過鑒定的DC、CIK按1∶5的比例聯(lián)合培養(yǎng)，3天后進(jìn)行抗肺腺癌細(xì)胞A549體外殺傷實(shí)驗(yàn)，同時(shí)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的表達(dá)。

1.6.1 培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞株A549 將在液氮中凍存的A549細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%IMDM的培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰酶消化，IMDM培養(yǎng)液洗滌后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104／ml，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl／孔，過夜培養(yǎng)。

1.6.2 DC聯(lián)合CIK以及單獨(dú)CIK對(duì)A549殺傷活性實(shí)驗(yàn) 將聯(lián)合培養(yǎng)的DC－CIK及CIK分別計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106／ml，按以下設(shè)計(jì)加入到已接種A549并貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)板中，效應(yīng)細(xì)胞（DCCIK，CIK）與靶細(xì)胞（A549）的比例為50∶1，每組6復(fù)孔。

實(shí)驗(yàn)分組：①DC－CIK；②CIK；③DC－CIK＋A549；④CIK＋A549；⑤A549。

以上細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)加CCK8，培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)492nm處各組光密度（OD）值，計(jì)算殺傷活性。

殺傷活性計(jì)算方法：殺傷活性＝［1－（實(shí)驗(yàn)組OD值－效應(yīng)細(xì)胞OD值／靶細(xì)胞OD值）］×100% 1.6.3 檢測(cè)DC－CIK及CIK細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞亞群 采用四色熒光標(biāo)記法標(biāo)記DC－CIK及CIK細(xì)胞［1］，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3＋、CD4＋、CD8＋、NK、NKT、活化T、活化B、CD8＋CD28＋的表達(dá)，用Cell Quest Pro軟件分析淋巴細(xì)胞群體百分含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS V16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用x—±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC－CIK以及CIK對(duì)A549殺傷活性比較，見表1。

表1 DC－CIK以及CIK對(duì)A549殺傷活性

2.2 DC－CIK聯(lián)合培養(yǎng)及CIK單獨(dú)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞亞群數(shù)值比較，見表2。

表2 DC－CIK聯(lián)合培養(yǎng)及CIK單獨(dú)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞亞群數(shù)值

3 討論

目前，生物療法在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用，免疫治療作為生物治療的組成部分，在腫瘤治療中起著尤為重要的作用。腫瘤免疫治療的主要目的是誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)來控制和清除腫瘤，而這種免疫反應(yīng)的產(chǎn)生需要專職抗原遞呈細(xì)胞（antigen－presenting cell，APC）的抗原遞呈作用。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是目前發(fā)現(xiàn)體內(nèi)最強(qiáng)的專職APC［2，3］，它可以激活初始型T淋巴細(xì)胞參與抗腫瘤反應(yīng)，在腫瘤的免疫治療中發(fā)揮重要作用［4，5］。細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cells，CIK）是一種抗腫瘤作用極強(qiáng)的腫瘤殺傷細(xì)胞［6，7］，由于其兼具有NK細(xì)胞無MHC限制性的殺瘤特點(diǎn)，以及T細(xì)胞特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，同樣在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)利用DC及CIK各自的抗腫瘤特性，將兩種抗腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，檢測(cè)其對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549的殺傷活性，并與單獨(dú)CIK抗A549活性進(jìn)行比較，為腫瘤生物治療提供有效方法。

本實(shí)驗(yàn)通過DC聯(lián)合CIK對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549進(jìn)行殺傷活性實(shí)驗(yàn)并與單獨(dú)CIK對(duì)549的殺傷活性進(jìn)行比較，證明DC聯(lián)合CIK對(duì)A549的殺傷活性明顯高于單獨(dú)CIK的作用（P＜0.01），說明DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)腫瘤的殺傷作用起到了相加的作用。另外，本實(shí)驗(yàn)通過檢查DC聯(lián)合CIK以及單獨(dú)CIK中淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)，證明DC－CIK細(xì)胞中CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋等抗腫瘤細(xì)胞數(shù)量均高于CIK細(xì)胞中的表達(dá)，這對(duì)DC－CIK抗腫瘤活性高于CIK的作用提供了支持。

淋巴細(xì)胞抗腫瘤作用的主要細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞。CD3＋細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞亞群的總和，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中起著重要作用，主要參與細(xì)胞免疫，而抗腫瘤的細(xì)胞主要為T淋巴細(xì)胞。T輔助細(xì)胞（CD3＋CD4＋）能識(shí)別抗原肽－MHC－II類復(fù)合物，并通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，輔助誘導(dǎo)其它免疫細(xì)胞如殺傷性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等的增殖和分化，共同發(fā)揮抗腫瘤作用；NK細(xì)胞（CD3－CD16＋CD56＋）是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，其殺傷性無MHC限制，它主要作用的靶細(xì)胞有腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞等；NKT樣淋巴細(xì)胞（CD3＋CD16＋CD56＋）因具有NK細(xì)胞無MHC限制的殺瘤特點(diǎn)以及T淋巴細(xì)胞特異性攻擊腫瘤的特性而得名，它具有對(duì)CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞抗腫瘤活性的調(diào)節(jié)能力，并能分泌TNF－α、IL－2、IFN－γ、IL－4等細(xì)胞因子；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CD8＋／CD28＋）是特異性抗腫瘤細(xì)胞，其數(shù)量越多，對(duì)腫瘤的殺傷力越強(qiáng)。DC－CIK除了高表達(dá)T淋巴細(xì)胞亞群外，其增殖率、分泌細(xì)胞因子等的能力也比CIK強(qiáng)［8－10］，這也是DC－CIK抗腫瘤活性高于CIK的重要因素。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明，DC－CIK聯(lián)合培養(yǎng)可以增加抗腫瘤細(xì)胞T淋巴細(xì)胞亞群百分比，所以其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性高于單獨(dú)CIK，也證明DC、CIK聯(lián)合培養(yǎng)可以起協(xié)同作用，提高抗腫瘤效果。

肺腺癌是肺癌的一個(gè)亞型，由于其易侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，成為臨床治療的難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以肺腺癌細(xì)胞A549作為DC－CIK及CIK的靶細(xì)胞進(jìn)行體外殺傷活性研究，希望為肺腺癌的治療提供除了手術(shù)、化療、放療等常規(guī)治療以外的治療方法，為肺腺癌的治療提供一種選擇，提高肺腺癌治療的總體療效。

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Experiment study of killing effect of DC and CIK co－cultured on tumor cells

ZHAO Xin，CHANG Ying，LIU Yu－xia，etal.（Jilin Province Tumor Hospital，Changchun130012，China）

ObjectiveTo discussion of cytotoxicity effects of DC（dendritic cells）and CIK（cytokine－induced cells）co－cultured on lung adenocarcinoma cell line A549，and Compare with CIK alone on A549killing activity，Provide an effective method for tumor biotherapy.Methods respectively cultured DC，CIK cell，and co－cultured after the identification，after 3days，to killing activity experiments on A549cell，detect cytotoxicity of DC joint CIK and separate CIK against A549，While using flow cytometry detect lymphocyte subsets expression of DC joint CIK and CIK alone.Results The cytotoxicity of DC joint CIK on A549was 88.38%，CIK was 66.24%，there were significant differences of cytotoxic activity on A549（P＜0.01）between，the number of lymphocyte subsets（CD3＋，CD4＋，NK，NKT，CD3＋HLADR＋，CD8＋CD28＋cell）of DC joint CIK was significantly higher than CIK.Conclusion The killing activity of DC and CIK co－cultured on A549lung cancer has significantly higher than that of single CIK cytotoxicity on A549（P＜0.01）.

dendritic cells；CIK cells；T lymphocyte subsets；killing activity

R734.2

A

2014－09－07）

1007－4287（2015）10－1636－03

＊通訊作者