麝香酮對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力的影響分析

劉敏婕，劉朋飛，趙 雷

（1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院·深圳市人民醫(yī)院a.手術(shù)室；b.麻醉科，廣東深圳518020；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林長春130021）

麝香酮對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力的影響分析

劉敏婕1a，劉朋飛2＊，趙 雷1b＊

（1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院·深圳市人民醫(yī)院a.手術(shù)室；b.麻醉科，廣東深圳518020；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林長春130021）

目的探索麝香酮對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力的影響，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨損傷修復(fù)方面的應(yīng)用開發(fā)新的方法。方法 采用密度梯度離心法，從大鼠骨髓中分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過CCK－8方法對細(xì)胞的增殖能力進行評價，并進一步通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面的特異標(biāo)記；用麝香酮（1.0mg／L）對細(xì)胞進行處理，分析處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨基因表達以及堿性磷酸酶活性方面的變化。結(jié)果 從大鼠骨髓中分離間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外條件下正常生長增殖，細(xì)胞CD29、CD44、CD90均呈陽性表達，CD45呈陰性表達，與正常間充質(zhì)干細(xì)胞的表型相符合；同時，實時定量PCR結(jié)果顯示，麝香酮處理后的細(xì)胞中，成骨基因ALP、Collagen I、Runx2和Osterix都有一定的上調(diào)趨勢，同時，細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性也有一定程度的升高。結(jié)論 麝香酮對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力有一定的促進作用，在利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行骨損傷修復(fù)的過程中具有一定的應(yīng)用價值。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；麝香酮；成骨分化

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1618）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow derived Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）是骨髓中存在的一類成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，而且在體外環(huán)境中具有較強的增殖能力和穩(wěn)定的性能，同時易于獲取［1－4］。這些優(yōu)勢使BMSCs在細(xì)胞工程、組織工程等方面均得到了廣泛的應(yīng)用，特別是在某些疾病的生物療法中，占據(jù)了重要的地位［57］。

近些年，相關(guān)研究報道：BMSCs在骨向分化以及骨損傷修復(fù)方面具有著重要的應(yīng)用前景［3，8，9］。所以，開發(fā)一種適合臨床需求的干細(xì)胞治療模式，對于BMSCs在骨損傷修復(fù)方面的應(yīng)用有著重要的促進作用。麝香酮是麝香的主要香味成分，臨床上主要用于治療冠心病心絞痛、血管性頭痛等，國內(nèi)學(xué)者肖慶忠等［10］發(fā)現(xiàn)：用麝香酮含藥血清對大鼠BMSCs進行處理后，細(xì)胞的增殖率、鈣鹽沉積量等均高于空白對照組。但是，這種含藥動物血清的模式明顯不適用與臨床需求，同時，麝香酮對大鼠BMSCs的直接作用也尚不明確。所以，在本課題中，課題組主要采用麝香酮直接作用的方法處理大鼠BMSCs，分析處理后的BMSCs在成骨能力方面的變化，為麝香酮在促進BMSCs成骨能力方面的合理化應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級Wistar大鼠，雄性，6－8周齡，體重160－180g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物中心提供，動物許可證號：SCXK－（吉）2007－0003。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM／F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶溶液均購自Gibco公司、胎牛血清（FBS）購自PAA公司，Percoll分離液購自Pharmacia公司，CCK－8試劑盒購自Dojindo公司，大鼠CD29－FITC、CD44－FITC、CD45－PE單克隆抗體購自BD公司，大鼠CD90－FITC單克隆抗體購自BioLegend公司，Trizol、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒購自Takara公司，麝香酮購自Santa公司，堿性磷酸酶活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

IX－70倒置相差顯微鏡購自O(shè)lympus公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購自BD公司，CFX96實時定量PCR儀購自BIO－RAD公司，EXL－808酶標(biāo)檢測儀購自BioTek公司。

1.3 大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定

分離獲取雄性wistar大鼠股骨和脛骨，并用PBS沖洗出骨髓，收集骨髓液后，采用1.073g／ml的Percoll分離液分離BMSCs（3 000rpm離心20 min），BMSCs用PBS洗1次后，于37℃、5%CO2條件下，用含有10%FBS的DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，此時的BMSCs記為第1代。細(xì)胞隔日換液1次，培養(yǎng)4－5天后進行首次傳代。

收集第3代的BMSCs進行增殖能力和表面標(biāo)記的分析。以1×103cells／孔的數(shù)量將BMSCs接種到96孔板中，用CCK－8試劑盒檢測BMSCs在24h、48h、72h和96h的增殖水平，評價BMSCs的增殖能力，以空白培養(yǎng)基作為背景組，實驗組絕對吸光度值＝實驗組吸光度值－空白組吸光度值，具體操作按CCK－8試劑盒說明書進行（n＝3）。將1×106BMSCs懸浮于0.1ml PBS中，大鼠CD29－FITC、CD44－FITC、CD45－PE、CD90－FITC均按1∶50的稀釋比例與BMSCs混合，于室溫孵育30min，用PBS清洗兩次后，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記的表達情況。

1.4 麝香酮對BMSCs成骨基因的表達影響

將麝香酮以1.0mg／L的濃度加入到BMSCs的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h，收集培養(yǎng)后的細(xì)胞，用Trizol裂解，提取細(xì)胞RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得基因組cDNA，采用實時定量PCR儀檢測細(xì)胞中成骨基因ALP、Collagen I、RunX2和Osterix的表達程度，具體操作均按照試劑盒說明書進行，實時定量PCR所用引物（5’－3’）如下：

ALP F－AGATGGACAAGTTCCCCTTG

R－ACACAAGTAGGCAGTGGCAGT

Collagen I F－TGGAAGAGCGGAGACTACTGGATT

R－TCTGGACGTTAGCGGTGTTGG

Runx2F－CTATCCAGCCACCTTCACTTACA

R－TCGCCAGACAGACTCATCCA

Osterix F－TATGCCAATGACTACCCACCCTT

R－TTGCCCACTATTGCCAACTGC

GAPDH F－GCCAGCCTCGTCTCATAGACA

R－AGAGAAGGCAGCCCTGGTAAC

1.5 麝香酮對BMSCs成骨分化過程中堿性磷酸酶活性的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，附加地塞米松1×10－4mM、β－甘油磷酸鈉10mM、維生素C 50mg／L，配制成骨分化培養(yǎng)基。用成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs，同時，在培養(yǎng)基中加入1.0mg／L的麝香酮，分別在分化誘導(dǎo)第1天、第3天、第5天和第7天，對比檢測麝香酮作用組與正常對照組（正常分化，無麝香酮作用）中BMSCs堿性磷酸酶（ALP）活性的變化，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)值以x—±s表示，各組之間比較采用t檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的分離和鑒定結(jié)果

大鼠BMSCs在體外條件下主要呈長梭形、貼壁狀態(tài)生長（圖1A），同時，在培養(yǎng)的過程中細(xì)胞具有一定的增殖能力，可以在體外培養(yǎng)的環(huán)境中正常的增殖，在培養(yǎng)48h－72h的過程中，細(xì)胞的增殖速度較快（圖1B）。

通過流式細(xì)胞儀檢測可見：大鼠BMSCs的CD29、CD44、CD90均呈陽性表達，表達效率均在90%以上（CD29：97.3%，CD44：96.5%，CD90：93.4%），而細(xì)胞的CD45呈陰性表達，表達效率僅為0.84%，這一結(jié)果與正常的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記相符合（圖2）。

圖1 大鼠BMSCs的形態(tài)及增殖評價結(jié)果

圖2 大鼠BMSCs的表面標(biāo)記鑒定結(jié)果

2.2 麝香酮對BMSCs成骨基因表達的影響

將未用麝香酮處理的BMSCs作為對照組，并將成骨基因在對照組的表達水平作為“1”，通過等比例比較麝香酮處理后的基因表達水平。通過結(jié)果分析可見：與未用麝香酮處理的細(xì)胞相比，在麝香酮的作用下，BMSCs的成骨基因ALP、Collagen I、RunX2和Osterix均有一定程度的上調(diào)（P＜0.05），但上調(diào)的程度各不一致（圖3）。所以，麝香酮對于正常BMSCs成骨分化基因的表達有一定的提升作用。

圖3 麝香酮作用下大鼠BMSCs成骨基因的表達變化（＊：P＜0.05）

2.3 麝香酮對BMSCs成骨分化過程中ALP活性的影響

通過成骨培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化，BMSCs的ALP活性逐漸升高。與未用麝香酮處理的細(xì)胞相比，在麝香酮作用1天后，BMSCs的ALP活性未見顯著改變，但是，在麝香酮作用3天后，BMSCs的ALP活性與對照組相比有明顯的升高（P＜0.05），而且，這種變化趨勢在以后的分化過程中仍然可以穩(wěn)定保持（圖4）。由此說明，麝香酮在BMSCs成骨分化的過程中，對細(xì)胞中ALP的活性也具有一定的促進作用。

圖4 麝香酮作用下大鼠BMSCs成骨分化過程中ALP活性的變化（＊：P＜0.05）

3 討論

近年來，麝香酮對干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，已逐漸引起了研究人員的關(guān)注。謝興文等［11］在構(gòu)建顱骨缺損的大鼠模型后，同時給以BMSCs和麝香酮，結(jié)果顯示：在麝香酮的作用下，BMSCs向損傷部位的遷移能力，明顯優(yōu)于未處理組。本課題組也在研究過程中發(fā)現(xiàn)：麝香酮對BMSCs的體內(nèi)外遷移能力具有一定的促進作用，除骨損傷模型外，在急性腎損傷模型中，這種促進作用也得到了一定的體現(xiàn)［12］。在體外的研究的過程中，課題組還發(fā)現(xiàn)：麝香酮對BMSCs的增殖和某些細(xì)胞因子的分泌能力也具有的一定的促進作用，特別是對BMP家族的因子分泌能力，有明顯的提升效果，這對于麝香酮促進BMSCs成骨能力，可能具有一定的意義［12］。

總的來講，本課題采用麝香酮直接作用處理的方法，驗證了其對大鼠BMSCs成骨能力的影響，初步證明了麝香酮對BMSCs的成骨能力和分化效果，均具有一定的促進作用，從而為BMSCs在骨損傷修復(fù)方面的應(yīng)用提供了一種新的模式。但是，這種優(yōu)化作用的深入機制，仍需要進一步的探索和研究。

［1］Kuo YR，Wang CT，Cheng JT，et al.Bone marrow－derived mesenchymal stem cells enhanced diabetic wound healing through re cruitment of tissue regeneration in a rat model of streptozotocininduced diabetes［J］.Plastic and reconstructive surgery，2011，128（4）：872.

［2］Miura Y，Yoshioka S，Yao H，et al.Chimerism of bone marrow mesenchymal stem／stromal cells in allogeneic hematopoietic cell transplantation：Is it clinically relevant［J］.Chimerism，2013，4（3）：78.

［3］Yu L，Tu Q，Han Q，et al.Adiponectin regulates bone marrow mesenchymal stem cell niche through a unique signal transduction pathway－an approach for treating bone disease in diabetes［J］.Stem cells，2015，33（1）：240.

［4］Liu N，Han G，Cheng J，et al.Erythropoietin promotes the repair effect of acute kidney injury by bone－marrow mesenchymal stem cells transplantation［J］.Experimental biology and medicine，2013，238（6）：678.

［5］Zeng X，Yu SP，Taylor T，et al.Protective effect of apelin on cultured rat bone marrow mesenchymal stem cells against apoptosis［J］.Stem cell research，2012，8（3）：357.

［6］Jin SZ，Liu BR，Xu J，et al.Ex vivo－expanded bone marrow stem cells home to the liver and ameliorate functional recovery in a mouse model of acute hepatic injury［J］.Hepatobiliary ＆pancreatic diseases international：HBPD INT，2012，11（1）：66.

［7］Liu P，F(xiàn)eng Y，Dong C，et al.Study on therapeutic action of bone marrow derived mesenchymal stem cell combined with vitamin e against acute kidney injury in rats［J］.Life Sci，2013，92（14－16）：829.

［8］Yamada Y，Nakamura S，Ito K，et al.A feasibility of useful cellbased therapy by bone regeneration with deciduous tooth stem cells，dental pulp stem cells，or bone－marrow－derived mesenchymal stem cells for clinical study using tissue engineering technology［J］.Tissue engineering Part A，2010，16（6）：1891.

［9］Rauh J，Jacobi A，Stiehler M.Identification of stable reference genes for gene expression analysis of three－dimensional cultivated human bone marrow－derived mesenchymal stromal cells for bone tissue engineering［J］.Tissue engineering Part C，Methods，2015，21（2）：192.

［10］侯費祎，謝興文，席芳琴，等.麝香酮含藥血清對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化的影響［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2013，31（1）：110.

［11］謝興文，侯費祎，李寧，等.不同濃度麝香酮對外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)遷移的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（7）：980.

［12］Liu P，F(xiàn)eng Y，Dong C，et al.Administration of bmscs with muscone in rats with gentamicin－induced aki improves their therapeutic efficacy［J］.PloS one，2014，9（5）：e97123.

Effect analysis of muscone on the osteogenic potential of rat bone marrow derived mesenchymal stem cells

IU Min－jie，LIU Peng－fei，ZHAO Lei.
（Operating Theatre，Second Clinical Medical College of Jinan University，Shenzhen People’s Hospital，Shenzhen518020，China）

ObjectiveTo explore the effect of muscone on rat bone marrow－derived mesenchymal stem cells（BMSCs）and develop a novel strategy for the application of BMSCs on the restoration of bone injury.Methods BMSCs were isolated from rat bone marrow with density gradient centrifugation and the proliferation ability and special makers on cell surface were evaluated with CCK－8methods and FACS respectively.After being treated with muscone（1.0mg／L），the expression of osteogenic genes and the activity of alkaline phosphatase in BMSCs were further analyzed.Results The rat BMSCs could proliferate in vitro normally.The cells showed a positive expression of CD29，CD44and CD90，as well as a negative expression of CD45，which coincided with the normal phenotype.Besides，the results of real－time quantitative PCR indicated that the expression of some osteogenic genes，ALP，Collagen I，Runx2and Osterix，were upregulated in some degree，and the activity of alkaline phosphatase in BMSCs was also enhanced with the treatment of muscone.Conclusion In summary，muscone holds the promoter action on the osteogenic potential of rat BMSCs and application value in the restoration of bone injury with BMSCs.

bone marrow－derived mesenchymal stem cells；muscone；osteogenic differentiation

R392.2

A

2014－12－22）

1007－4287（2015）10－1618－04

深圳市知識創(chuàng)新計劃（JCYJ20140416122812052）；深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目（201401010）

＊通訊作者