MMP—1/TIMP—2在子宮內膜異位癥中的表達

摘要：目的探討基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）/其組織金屬蛋白酶抑制劑-2（TIMP-2）在子宮內膜異位癥中表達的特點?相關關系及影響?方法： 采用 as及SP免疫組化法檢測異位內膜組織（30例）和正常子宮內膜組織（30例）中MMP-1/TIMP-2 mRNA及蛋白的表達?結果： MMP-1和TIMP-2的mRNA及蛋白在人異位內膜組織中均有表達，其中MM-1相對表達量均明顯高于正常子宮內膜?差異顯著（P<0.05）：TIMP-2表達低于正常內膜組織?各組MMP-1/TIMP-2比值均顯著高于正常子宮內膜組（P<0.01）?結論MMP-1和TIMP-2在人異位組織中異常表達?動態平衡紊亂，在子宮內膜異位癥中的發生發展中起重要作用異位位內膜組織具有較強的侵襲性，可能是異位內膜發生種植的源頭因素?

關鍵詞：子宮內膜異位癥；基質金屬蛋白酶-1；金屬蛋白酶組織抑制因子-2；

Objective： To investigate the expression，relationship and influences of matrix metalloproteinases-1 （MMP-1） /tissue inhibitor of metalloproteinase-2 （TMP-2） in endometriosis.Methods： Determinating the expression of MMP-1/TIMP-2 mRNA and protein in endometrial tissues of ectopic and normal person using RT-PCR and SP immunohistochemical method.Results： Both MMP-1 and TIMP-2 are expressed in endometrial tissues of ectopic group and the expression of MMP-1 mRNA and protein were higher in ectopic group than normal significantly，p<0.05； the expression of TIMP-2 mRNA and protein were lower in ectopic group than normal； MMP-1/TIMP-2 was higher in ectopic group than normal significantly，p<0.01.Conclusion： Both MMP-1 and TIMP-2 are expressed abnormally in endometrial tissues of endometriosis. Disorder of dynamic balance plays a vital role in endometriosis. Ectopic endometrial tissues are aggressive and may be primary causes of endometriosis.

Key words： endometriosis；MMP-1； TIMP-2.

【中圖分類號】R711.71 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-8602（2015）04-0577-02

子宮內膜異位癥是內膜細胞種植在不正常的位置而形成的一種女性常見婦科疾病[1]?是育齡期婦女的多發病，是引起80% 患者慢性盆腔疼痛，30% 婦科手術和20% 患者不孕的主要原因?子宮內膜異位癥具有類似惡性腫瘤遠處轉移和種植生長的能力，可導致痛經?慢性盆腔痛?性交痛及不孕等癥狀[2?3]?目前對此病發病的機理有多種說法，其中被普遍認可的是子宮內膜種植學說?此外，子宮內膜異位癥的發生還與機體的免疫功能?遺傳因素?環境因素有關?

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs ） 直接或間接參與胚胎發育?組織模型再塑及創傷修復等正常生理過程?子宮內膜異位種植類似于腫瘤侵襲，需要降解細胞外基質，在這一過程中，MMPs發揮了重要作用[4]?MMP-1是MMPs家族中的主要成員，是細胞外基質代謝的主要調節者?本研究探討MMP-1及其組織金屬蛋白酶抑制劑-2在子宮內膜異位癥患者子宮內膜中的表達，進一步探討子宮內膜異位癥細胞異位黏附，侵襲及生長機制[5]?

1材料與方法

1.1免疫組化SP 法 所有標本均在開腹手術時采集，立即用10%的甲醛固定，常規脫水及石蠟包埋?每份標本常規HE 染色后，光鏡下觀察組織學形態，篩選組織標本?切片厚度為4ìm，一抗試劑鼠抗人MMP- 2?MMP- 3?TIMP- 1單克隆抗體購自美國Neomarkers 公司，二抗購自中山生物技術有限公司SP 試劑盒（ 通用型） ?操作流程嚴格按試劑盒說明書進行?用已知的陽性乳腺癌切片作陽性對照，PBS 代替?一抗作陰性對照?

1.2實時定量PCR反應（Real-Time PCR）：采用SYBR GreePCR Master Mix，在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，使其特異性地摻入DNA雙鏈后發射熒光信 號，而不摻入鏈 中的SYBR染料分子則不會發射熒光信號，從 而保證熒光信號的增加和PCR產物的增加完全同步?在96孔板中加入SYBR混合試劑10 ìl?引物上下游各1 ìl?cDNA1 ìl?Nuclease-Free Water 7 ìl補足至20 ìl?建立PCR產物溶解曲線，U6為內參?實時定量PCR循環條件：STAGE1：95°C 10 min；STAGE2：95°C 15 sec，60°C 1 min；STAGE3：95°C 15 sec，60°C 1 min；95°C 15 sec；60°C 15 sec?

1.3結果判定 細胞間質中出現棕黃色或褐色顆粒為陽性?根據陽性細胞百分率及顯色深淺分級?（ 1） 陽性細胞百分率： 無細胞顯色或陽性細胞數< 5%為0： 5%～ 35% 細胞顯色為1，36%～ 65%細胞顯色為2； > 65%細胞顯色為3； （ 2） 顯色深淺： 不顯色或顯色不清為0； 淺黃色為1； 棕黃色為2； 深褐色為3?將二者的評分相加除以2，作為該切片的最終評分： 將0?0～ 1?1. 5 ～ 3 分分別定為陰性（ - ） ?陽性（ + ） ?強陽性（ + + ） ?

1.4統計方法 利用Kruskal- Wallis H 檢驗和Nemenyi 檢驗?

2結果

2.1免疫組化法示異位組較空白組?在位組MMP-1表達高，TIMP-2表達低，差異有統計學意義；空白組?在位組MMP-1低表達，TIMP-2高表達，差異無統計學意義，見表1

2.2 RT-PCR法示異位組較空白組?在位組MMP-1表達高，TIMP-2表達低，差異有統計學意義；見圖2

3討論

由于E M S 具有類似惡性腫瘤浸潤轉移的特性，大多數研究著重于腫瘤轉移促進因子在E M S 發病中的作用，腫瘤侵襲轉移涉及到腫瘤細胞與宿上細胞的黏附性?腫瘤細胞的運動?細胞外基質的降解等過程【6】，其中細胞外基質的降解是腫瘤細胞侵襲轉移的前提?研究證明子宮內膜碎片必須像腫瘤組織一樣通過黏附?侵襲和血管形成，才可以生存?生長，并引起病變和癥狀力【7】?細胞外基質的降解是新生血管形成及組織結構重建的先決條件，許多因子在子宮內膜組織異位種植?細胞外基質降解的過程中發揮重要作用，細胞外基質的降解涉及到多種水解酶【8】?而M M P s 與細胞外基質降解密切相關，其中M M P - 1 是細胞外基質代謝的主要調節者?

本研究結果表明，在正常穩定狀態，組織中M M P -1 表達量極少，而在某些因素刺激下表達量上升?目前認為E M S 是與炎癥和凋亡能力下降相關的一種慢性疾病，一旦異位病灶形成，它們就開始分泌多種促炎W 子?研究表明，在位內膜自身免疫調作的異常，與E M S 的發生發展互為因果，異常的內膜免疫環境抑制內膜細胞凋亡?改變內膜功能基因的表達，可能導致M M P -1 的表達升高，降解細胞外基質，而為內膜的異位?黏附?種植?生長增進血管的生成及結構的重建【9】；M M P s 可能受雌激素分泌的類固醇激素調節，類固醇激素通過刺激子宮內膜產生一組具有生物活性的生長因子，促進如M M P - 1 的表達，從而調節月經期的內膜組織重構，促進腹腔內的子宮內膜的異位，并調控疾病的發展過程【10】?本研究未涉及M M P s 與其他因素的聯合研究?

目前，臨床主要是采用“ 手術為主，藥物為輔”的治療策略，但手術復發率高，藥物治療仍居重要地位，理想的治療E M S 的藥物應該是在緩解疼痛的同時，不抑制排卵和月經，能長期安全使用，甚至有望實現E M S 的手術治療向藥物治療的模式轉變?

參考文獻

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