微生物來源a—L—鼠李糖苷酶的分子和結構生物學研究進展

張霞 李利君 倪輝 蔡慧農 蘇文金

摘要：a-L-鼠李糖苷酶（a-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40））是一種水解酶，分布在GH13、GH28、GH78和GH106家族，其中3種GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶具有典型的（α/α）6桶狀結構，它能夠特異性地水解許多糖苷類物質末端的α-L-鼠李糖基，在食品飲料加工工業和醫藥業中具有重要的應用價值。介紹了微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶的性質及應用，主要闡述了α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表達及該酶晶體結構方面的研究進展。

關鍵詞：α-L-鼠李糖苷酶；基因克隆；基因表達；晶體結構

中圖分類號：Q71；Q786 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）01-0068-07

ProgressesonMolecularBiologyandStructuralBiologyofα-L-rhamnosidasefromMicrobialSources

ZHANGXia1，LILi-jun1*，NIHui1.23，CA1Hui-nong1.2，3，SUWen-jin1，2，3

（1.CollegeofBioengineering，JimeiUniversity，Xiamen361021，Fujian，China；2.ResearchCenterofFoodMicrobiologyandEnzymeEngineeringTechnology，Xiamen361021，Fujian，China.，3.ResearchCenterofFoodBiotechnologyofXiamenCity，Xiamen361021，Fujian，China）

Abstract：a-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40）cleavesterminalα-L-r

hamnosespecificallyfromalargenumberofglycosides.Theenzymeisabiotechnologicallyimportanthydrolyticenzymeduetoitsapplicationsinthefoodandbeverageprocessingindustryandpharmaceuticalindustry.Basedonprimarysequencesimilarities，α-L-rhamnosidasesareclassifiedwithintheCarbohydrate—activeenzymes（CAZy）databaseintofourglycosidehydrolase（GH）families（GH13，GH28，GH78andGH106family），andthreeα-L-rhamnosidasesofGH78haveatypical（α/α）6-barrelstructure.Propertiesandapplicationsofα-L-r

hamnosidasefromdifferentmicrobialsourceshavebeenintroduced.Inaddition，therecentdevelopmentsoncloning，expressionofoiLi.hamnosidasegeneandthecrystalstructureoftheenzymeweresummarized.

Keywords：α-L-rhamnosidase；genecloning；geneexpression；crystalstructure

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：068?074）

α-L-鼠李糖昔酶（α-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40））屬于轉化糖苷水解酶類，能夠專一、高效地水解許多糖苷類物質如柚皮苷（naringin）、蘆丁（rutin）、橙皮苷（hesperidin）等末端的α-L-鼠李糖基[1]。α-L-鼠李糖苷酶的來源廣泛，在動物組織、植物和微生物中均發現了α-L-鼠李糖稈酶。目前關于動物組織[2]和植物來源的α-L-鼠李糖苷酶的報道相對較少，主要是通過細菌（如芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、乳桿菌屬及單胞菌屬等）和真菌（如曲霉屬、青霉屬、木霉屬、犁頭霉屬及裂殖菌屬等）發酵來獲取α-L-鼠李糖苷酶。

不同微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶酶學性質存在差異。細菌來源的α-L-鼠李糖苷酶最適pH呈中性或堿性，而真菌分泌的α-L-鼠李糖苷酶的最適pH一般在酸性范圍內，主要在4.0～7.0[3-5]之間。微生物中的α-L-鼠李糖稈酶的最適反應溫度一般是45?60℃[4、6]。近年來也有發現耐熱、嗜低溫及耐堿性的α-L-鼠李糖苷酶，如白曲霉MBRC4308[6]分泌的α-L-鼠李糖苷酶，在60℃保溫1h后酶活仍有初始酶活的80%；ThermophilicbacteriumPRI-1686[7]產生的α-L-鼠李糖苷酶最適溫度為70℃，在60℃處理24h后酶活為處理前的20%；而亞南極環境中的單胞菌屬細菌[8]中的α-L-鼠李糖苷酶在-1-8℃具有活性。Rojas[9]等從白黃筍頂孢霉菌（Acrostalagmus luteo albus）分離到一種新型堿性α-L-鼠李糖苷酶，以對硝基苯酚-α-I-鼠李糖苷（pNPR）為底物測得酶反應的最適pH值為8.0，它可以在堿性條件下水解橙皮苷、柚皮苷以及槲皮苷等糖苷物質，擴大了α-L-鼠李糖苷酶的應用范圍。

α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橙皮背酶的主要活性成分，是去除柑梧類果汁苦味的有效物質[1]。果汁中的苦味物質柚皮苷被柚苻酶水解的過程共有兩步反應，首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮背生成普魯寧，接著在β-D-葡萄糖苷酶的作用下，生成柚皮素。在果汁酶法脫苦過程中，α-L-鼠李糖苷酶參與的第一步反應是脫苦的關鍵，Chien[10]等用HPLC法證明僅有柚苷酶的另一組份β-D-葡萄糖背酶存在時，苦味物質抽皮苷是不能被水解的。有研究報道，對葫溪蜜柚果汁進行脫苦時，在α-L-鼠李糖苷酶加量為10U/mL的條件下40℃處理60min，苦味就能降低到閾值以下[11]。除了在飲料行業中用來去除柑橘類果汁的苦味[3、12]，在其他行業也具有很多潛在的應用價值，如通過水解柚皮苷生產L-鼠李糖[1]和普魯寧降低黃酮類化合物的生產成本；增加釀造酒的香味[14、15]，改善葡萄汁和飲料的香氣成分；切除一些糖苷類藥物原料末端的L-鼠李糖等[16]。由于α-L-鼠李糖苷酶的重要應用價值，越來越多的國內外學者致力于該酶的研究開發。本文分別對微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表達以及該酶的晶體結構研究進展進行了闡述。

1α-L-鼠李糖苷酶的分子生物學研究

微生物分泌的α-L-鼠李糖苷酶是一種誘導酶，需要誘導物柚皮苷、橙皮苷、鼠李糖等存在時才能合成α-L-鼠李糖苷酶，而且微生物中α-L-鼠李糖苷酶的誘導受到碳源代謝調節，給微生物發酵產α-L-鼠李糖苷酶造成阻礙。同時隨著α-L-鼠李糖苷酶的應用越來越廣泛，傳統發酵的生產方式不能滿足日益增長的需求，也很難達到很高的純度。因此，選擇現代生物技術來研究α-L-鼠李糖苷酶是一種必然趨勢

1.1α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆

早期對a-L-鼠李糖苷酶的研究主要是該酶的分離純化及酶學性質，2000年后對α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究日漸增多，表1列舉了2000年以來微生物中GH78家族和近兩年其他家族已克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因目前，從微生物中克隆α-L-鼠李糖苷酶基因主要采用PCR和構建文庫的方法。據PuriM等報道，采用構建文庫的方法克隆α-L-鼠李糖苷酶基因可以通過以下兩種方法篩選陽性克隆；一種是利用pNPR作為底物篩選含有α-L-鼠李糖苷酶活性的陽性克隆；另外一種是采用多克隆抗體篩選產鼠李糖苷酶的陽性克隆。

細菌來源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究比真菌稍早，在2000年[18]就有學者報道對Clostridium.stercorarium菌株中鼠李糖苷酶基因ramA的克隆。有些細菌中存在多個編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，且它們的序列存在差異，在Bacillussp.GLl[31]中克隆到rhaA和rlmB兩個編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，它們分別編碼兩個不同的α-L-鼠李糖苷酶。來自植物乳酸桿菌（Latto-bacillusplantarum）[23]的rhaB1和rhaB2都是編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，它們的序列相似性僅為26%。不同細菌中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因序列各異，Bacillussp.GLl[31]中rhaA和rhaB與Clostridiumstercorarium中ramA序列相似性分別為41%和23%。植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）[23]中的α-L-鼠李糖酶KhaB1和RhaB2與Bacillussp.GLl[31]中該蛋質（登錄號：BAB62315）的氨基酸序列相似性均為23%，與ThermomicrobiaPRI-1686[7]中的RhaB（登錄號：AAR96047）相似性分別為22%和23%。而少動鞘氛醇單胞菌FP2001（Sphingornonaspaucimobilis）[21]中克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因rhaM，共有3354個核苷酸，同源性比對發現它與其他屬于糖基水解酶（GH）家族78的α-L-鼠李糖苷酶基因沒有顯著的同源性。

國外關于真菌中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究主要集中在來源于曲霉屬的α-L-鼠李糖苷酶目前，曲霉屬中的棘孢曲霉[19]、白曲霉[6]和構巢曲霉[29]等已有克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的研究報道。對目前已知的α-L-鼠李糖苷酶基因序列的分析發現，不同來源的α-L-鼠李糖苷酶基因序列差異較大。從棘孢曲霉[19]中克隆的兩種編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因rhaA和rlmB的核苷酸序列幾乎沒有相似性，二者氨基酸序列相似性為60%，而它們與Clostridiumstercorarium中該酶的氨基酸序列[18]的一致性僅有11%。白曲霉中[6]α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列與棘孢曲霉[19]中rhaA和rhaB的氨基酸序列相似性分別為75%和67%，與細菌[7、18、20、21]來源的α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列一致性低于30%。有些真菌中存在著多個編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，如在棘孢曲霉[19]中分離到兩種α-L-鼠李糖苷酶，并克隆了它們對應的基因：有研究者對構巢曲霉[29]的基因組信息進行分析發現，至少存在8個可能具有α-L-鼠李糖苷酶功能的基因，而目前已克隆到rhaA和rhaE兩種：我國學者對α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究相對較晚，主要是對犁頭霉屬[32-34]的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆，已成功克隆出蘆丁-α-鼠李糖苷酶基因cDNA片段[32]和人參皂甙-α-鼠李糖苷酶基因[33、34]。近年有研究者從黑曲霉DLFCC-90菌株[26]中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，該序列和α-淀粉酶的序列有較高的同源性，被歸類到糖苷水解家族GH13。此外，筆者巳經從黑曲霉JMU-TS528（集美大學生物工程學院發酵工程研究室保藏的菌株）中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，共編碼655個氨基酸，序列已上傳至NCBI數據庫（登錄號：KC750908.1），經同源性比對發現，它與白曲霉[6]（AB374267.1）中的α-L-鼠李糖苷酶基因的相似性高于90%。

雖然對微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的報道越來越多，但對該基因在轉錄水平上的調控研究并不多。目前，僅指出α-L-鼠李糖苷酶基因的表達量受誘導碳源的影響，葡萄糖在轉錄水平抑制該基因的表達。因此，筆者認為今后的研究可在克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的基礎上進一步鑒定與該基因跨膜轉移或翻譯直接相關的基因和蛋白，闡明葡萄糖抑制基因與α-L-鼠李糖苷酶基因相互作用的關系，從而明確碳源代謝調控α-L-鼠李糖苷酶基因的機制。

1.2α-L-鼠李糖苷酶基因的表達

通過α-L-鼠李糖苛酶水解柚皮苷生產普魯寧可以降低普魯寧的生產成本，但目前報道的α-L-鼠李糖苷酶大多數是以柚苷酶的形式存在，而在柚苷酶水解柚皮苷的過程中，普魯寧作為一種中間產物，會進一步被分解成柚皮素，不能大量積累普魯寧。所以表達出只具α-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白質具有重要的應用價值。近幾年有人對α-L-鼠李糖苷酶基因的表達進行了研究，表2列出了具有代表性的微生物中α-L-鼠李糖苷酶基因表達出的具有活性的蛋白。

在研究α-L-鼠李糖苷酶基因表達時，大腸桿菌是研究者常用的表達宿主。雖然采用原核表達系統來表達真核微生物中的基因容易出現沒有活性的產物，目前已有不少研究者將微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶基因，通過大腸桿菌表達出有活性的蛋白。如Jules[22]等將植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantaram.）和嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）中克隆得到的鼠李糖苷酶基因ram1Lp、ram2Lp和ramALa，在E.coli中表達出活性蛋白Ram1Lp、Ram2Lphe RamALa，其中RamALa酶活最大，達到8.5mU/μg。不同的α-L-鼠李糖苷酶基因表達后產物的水解底物不同，乳酸片球菌[24]中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因ram和ram2，采用E.coli表達系統成功表達出活性蛋白Ram和Ram2，但Ram只能有效地水解合成底物pNPR，而Ram2能特異性水解橙皮苷和蘆丁糖，兩種酶均不能水解柚皮苷，以pNPR為底物測得Ram和Ram2的酶活分別為8.7U/mg和0.036U/mg。植物乳酸桿菌NCC2451231中rhaB1和rhaB2基因表達的RhaBl和RhaB2能特異性地水解α-1，6糖苷鍵，但不能水解柚皮苷中的a-1，2糖苷鍵，RhaB1和RhaB2的最適底物是橙皮苷和蘆丁。有研究者發現有些細菌中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因表達后的產物是二聚體，例如Clostridium stercorarium[18]中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因ramA成功在（PWS1261）細胞中表達出的蛋白Ram78A包含兩個相同的亞基，Lactobacillusplantatum[23]中rhaB1和rhaB2基因采用E.coli表達出的α-L-鼠李糖苷酶以二聚體形式存在。

由于原核表達系統本身存在的一些缺陷，有時表達出的α-L-鼠李糖稈酶不具有活性[36]，所以有研究者采用真核表達系統來表達α-L-鼠李糖苷酶基因。目前對α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表達的報道并不多，我國研究者已在酵母中成功表達了蘆丁鼠李糖苷酶基因[36]、人參皂苷-α-鼠李糖苷酶基因[33]以及黑曲霉中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因[26]。其中黑曲霉中的α-L-鼠李糖苷酶基因序列與α-淀粉酶基因序列相似性較高，通過酵母表達后的產物具有水解蘆丁、柚皮苷及橙皮苷的功能。米用酵母細胞表面展示技術將Alternaria sp.L1[28]中rhal1編碼的α-L-鼠李糖苷酶固定在釀酒酵母細胞表面，該細胞能特異性地水解葡萄柚果汁中的柚皮苷達到果汁脫苦的作用。RhaL1固定在釀酒酵母細胞表面后，該酶在70℃環境中活性很高，在60℃處理2h后酶活達到處理前的95%，擴大了該酶在工業生產中的應用范圍。目前對黑曲霉來源的α-L-鼠李糖苷酶基因的異源表達研究較少，筆者正在研究從黑曲霉jMU-TS528菌株中克隆到的α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表達。國外的研究者報道了土曲霉[25]、構巢曲霉[29]和棘孢曲霉[35]中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因在酵母中的成功表達。鼠李糖能夠誘導構巢曲霉[29]中rhaE的表達，葡萄糖對該基因的表達產生抑制作用，rhaE在釀酒酵母中表達的產物，能夠水解底物pNPR，酶活達到1.4U/mL。通過系統發育樹分析發現，在真菌來源的α-L-鼠李糖苷酶基因中，rhaE是首個與細菌中α-L-鼠李糖苷酶基因親緣關系比其他真菌中的α-L-鼠李糖苷酶基因更近的基因。土曲霉中α-L-鼠李糖苷酶基因采用酵母表達系統得到的產物和天然發酵的α-L-鼠李糖苷酶一樣，都可以水解蘆丁，重組酶酶活力高達9U/mL，比天然酶高出3倍，而且大大縮短了天然發酵獲取α-L-鼠李糖苷酶的時間，同時酶的產量比天然發酵的α-L-鼠李糖苷酶提高了4倍。盡管近年來，利用基因工程技術來構建產α-L-鼠李糖苷酶的工程菌的研究逐漸增多，并取得了一定的進展，但酶活水平始終未能達到工業化應用的要求；目前國際上對α-L-鼠李糖苷酶分泌機制的研究也不多，因此如何進一步提高該酶的胞外分泌水平，是該酶能否得到推廣應用的關鍵：

2α-L-鼠李糖苷酶的結構生物學

蛋內質需要形成一定的空間結構才能有活性，近年來，雖然對α-L-鼠李糖苷酶基因克隆和表達的報道很多，佴對它的結構方面的研究報道還比較少：2000年Zverlov成功克隆Clostridiumstercorarium[18]中編碼α-L-鼠李糖苷酶基因ramA后，首次通過圓二色譜法測得該酶二級結構包含27%的α-螺旋和50%的β-折疊結構。

CAZy（http：//www.cazy.org/）數據庫依據氨基酸序列相似性對糖苷水解酶類進行了分類，微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶包含在GH13、GH28、GH78和GH106糖苷水解酶家族中。目前，由PDB數據庫可以査詢到3個鼠李糖苷酶的晶體結構，分別是來自Bacteroides thetaiutaomicronVPI-5482菌中的α-L-鼠李糖苷酶（PDBcode：3CIH）、Bacillus sp.GLI（PDBcode：20KX）和Streptoinycesavermitilis（PDBcode：3W5M、3W5N）菌株中α-L-鼠李糖苷酶。Cui[31]等于2007年解析了α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）的晶體結構，該酶由N、D1、D2、C和A5個結構域組成；結構域A包含其（α/α）6的桶狀結構，Asp567、Glu572、Asp579和Glu841在該酶的催化作用和底物結合方面起到了關鍵作用，它們與鼠李糖相互作用，將其突變后，α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）酶活大幅度降低；并認為RhaB的空間結構與Lactobacillusbrevis菌株的麥芽糖磷酸化酶MalP和Vibrioproteolyti-cus菌株的殼二糖磷酸化酶ChBP的結構相似。來自Streptmnyces avermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶（SaRha78A）的晶體結構有兩種，一種是原蛋白形式，另外一種是包含L-鼠李糖的晶體結構，這兩種形式的結構變化很小，RMSD值僅為0.21A，它們均由1個α和5個β結構域組成，分別是N、D、E、F、A和C；結構域A包含（α/α）6的桶狀結構，與Cui[31]等報道的RhaB的催化域相似；SaRha78CM由13個α-螺旋組成，結構域N包含10個β-折疊，結構域D的11個β-折疊和E的13個β-折疊展現出一個β-卷心折疊，結構域F由16個β-折疊組成兩個平行的β-折疊片；L-鼠李糖分別結合在結構域A和D中，結構域A中的L-鼠李糖結合在該酶的活性口袋的芳香基氨基酸TrP747和TrP640之間，與周圍的氨基酸形成12個氫鍵，結合后的船型構象被認為是GH78家族α-L-鼠李糖苷酶水解聚糖的過渡態構象；結構域D中的L-鼠李糖結合在β-折疊間，L-鼠李糖的O2、O3和O4原子分別和α-L-鼠李糖苷酶的Trp203、Asnl80和AsP179形成氫鍵，L-鼠李糖的O3、O4位置與一個正二價鈣離子形成配位共價鍵，同時鈣離子與該酶通過Aspl79、ASnl80、Asn228和Pro233氨基酸產生相互作用：Glu636和Glu895是在該α-L-鼠李糖苷酶的催化作用中的關鍵氨基酸，Glu636在催化過程中提供質子，將其突變后，該酶酶活下降了40倍。通過對α-L-鼠李糖苷酶的晶體結構的分析發現，該酶有4個結構域高度保守（RhaB：A、C、D2、D1；SaRha78A：A、C、E、F），GH78家族α-L-鼠李糖苷酶的催化域是一個（α/α）6的桶狀結構，鼠李糖結合在該桶狀結構的深溝里[31]。此外，在streptomyces awermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶中還發現了一個新的非催化碳水化合物結合域（non-catalyticcarbohydratebindingmodule，SaCBM67），SaCBM67位于結構域D，通過鈣依賴的方式與L-鼠李糖結合，在用EDTA螯合鈣之后，SaCBM67失去與L-鼠李糖結合的功能。通過對179和180位置的氨基酸的突變實驗發現，突變后該酶水解阿拉伯樹膠的活性大大降低，而對水解芳香基鼠李糖苷的活性影響不大，研究者認為SaCBM67對該菌株中的α-L-鼠李糖苷酶酶活有著一定的影響。

3展望

微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶具有很多潛在的應用價值，近年來，對該酶的研究越來越受到學者的關注，從不同水平對α-L-鼠李糖苷酶進行了研究。首先，在α-L-鼠李糖苷酶產酶菌株的篩選、發酵條件的優化以及酶的分離純化和性質研究日趨成熟，為產業生產α-L-鼠李糖苷酶酶制劑及α-L-鼠李糖苷酶在食品醫藥加工工業中的應用提供了一定的參考價值；其次，在分子生物學方面，對不同來源的α-L-鼠李糖苷酶基因進行了克隆，并通過生物信息學分析、基因的表達以及晶體結構的研究，使得對α-L-鼠李糖苷酶的了解進一步深入。這些研究為構建工程菌生產α-L-鼠李糖苷酶，提高α-L-鼠李糖苷酶的酶產量，降低目前生產α-L-鼠李糖苷酶的成本提供了理論指導。但目前對不同來源的α-L-鼠李糖苷酶的合成途徑、誘導機制和催化機制研究較少，因此，可進一步通過利用分子生物學、結構生物學和計算生物化學等技術，對α-L-鼠李糖苷酶進行更深層次的研究。從分子水平上來研究α-L-鼠李糖苷酶的催化機理，結合定點突變等技術來提高α-L-鼠李糖苷酶的催化活性。同時，通過計算模擬等手段研究α-L-鼠李糖苷酶的底物結合特異性，擴大α-L-鼠李糖苷酶在各生產工藝中的應用范圍因為自然分離純化的酶難以滿足苛刻的工業生產過程，所以酶的改造成為一種非常有效的替代途徑，依照α-L-鼠李糖苷酶的晶體結構信息，加深對其結構和功能的認識，為α-L-鼠李糖苷酶定向進化和改造奠定理論基礎：

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