草魚促性腺激素受體的克隆及表達分析

佘冬蓮 陳文娟 王艷杰 周毅 劉瓊 李建中

摘要：利用KT-PCK技術從草魚性腺中克隆出兩種促性腺激素受體基因（FSHR和LHR），采用N-J法構建了系統進化樹。通過IVr-PCK及Keal-timePCR技術對FSHR和LHR在成體草魚不同組織中的時空表達進行分析，發現和LHR在草魚卵巢、精巢中表達明顯，表達量隨著卵母細胞的發育逐漸增高，以上結果為進一步探討GTHR在魚類生殖周期中的生理功能奠定了基礎。

關鍵詞：草魚；促性腺激素受體；基因克隆；表達分析

中圖分類號：Q785；Q786 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）01-0039-05

MolecularGeneCloningandExpressionofGonadotropinReceptorsfromCtenopharyngodonidella

SHEDong-lian，CHENWen-juan，WANGYan-jie，ZHOUYi，LIUQiong，LIJian-zhong

（CollegeofLifeSciences，HunanNormalUniversity，Changsha410081，Hunan，China）

Abstract：Twotypesofgonadotropinreceptors（FSHRandLHR）wereclonedfromthegonadsofgrasscarphyRT-PCR.Thephylogenetic*treeofGTHRbetweendifferentspeciesbyN-Jmethodwasconstructed.ThetemporalandspatialexpressionofdifferenttissuesinadultgrasscarphyRT-PCRandReal-timePCRwasanalyzed.TheresultindicatedthatFSHRandLHRweremuchhigherexpressedingonads，andtheexpres?sionlevelwassignificantlyincreasedinmatureoocytes.TheseresultslaidafoundationforthefurtherstudyonGTHRreproductivefunctionsinfish.

Keywords：grasscarp；gonadotropinreceptors；genecloning；expressionanalysis

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：039?043）

脊椎動物的生殖周期主要由下丘腦一垂體一性腺軸調控，而垂體分泌的促性腺激素（go-nadotropinhormone，GTH）在脊椎動物的生殖周期調控中占據中心地位，是促進性腺發育與成熟的關鍵性激素[1、2]。但是，促性腺激素必須與相應的受體結合才能行使其生物學功能，通過對促性腺激素受體（gonadotropinreceptors，GTHR）的研究有利于我們進一步了解GTH在魚類生殖周期調控中的生物學功能[3]。在魚類中，存在兩種類型的促性腺激素受體GTHRⅠ和GTHRⅡ，——對應著哺乳動物中的促卵泡素受體（follicle-stimulatinghormonereceptor，FSHR）和促黃體生成素受體（luteinizinghormonereceptor，LHR）[4-7]。到目前為止，FSHR和LHR基因已經在日本鰻鱺japonica）、非洲鯰魚（Clariasgariepinus）、斑馬魚（Daniorerio）、大西洋娃（Scdmosalar）、斜帶石斑魚（Epinepheluscoioides）、西氏擬隆頭魚（sieboldi）、牙漢魚（Odontesthesbonariensis）等多種硬骨魚[8-14]的性腺中被克隆，但在國內尚未見相關的研究報道。

草魚（Ctenopharyngodonif/eWa）屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科魚類，是我國四大家魚之一，是內地淡水經濟魚類中價值較高的優質魚類之一。本實驗室在草魚腦垂體的起源和發生以及外源激素對草魚腦垂體GTH細胞的影響等方面巳經做了大量的工作但是，在分子生物學方面，我們對草魚生殖周期調控的分子機理還知之甚少，有必要進行深入的研究。本研究從分子生物學方面著手，對草魚FSHR和LHR基因進行了克隆、表達及分析，對于進一步闡明促性腺激素及其受體在硬骨魚類生殖周期調控中作用的分子機制，完善魚類（特別是鯉科魚類）的繁殖內分泌學研究有重要的理論意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料

大腸桿菌E.coli DH5α湖南師范大學魚類發育實驗室保存，本實驗所用草魚來自本實驗室養殖基地。

1.1.2試劑

無水乙醇、二甲苯、石蠟、甲醛、冰醋酸、苦味酸、蘇木精、中性樹膠（國產）；RevertAidFirst-strandcDNASynthesisKit、dNTP、TaqDNApoly?merase、DnaseI酶（美國Fermentas公司）；瓊脂糖（西班牙BI0WEST公司）、胰蛋白胨、酵母提取物（0X0ID），焦碳酸二乙醋（diethylpyrocarbonate，DE-PC），氨芐青霉素、EB染液、DNA膠回收試劑盒（Sangon公司）；E.Z.N.A.TotalRNAKitI（美國Omega公司）；pMD18-TVector，DNA純化試劑盒（日本Takara公司）；SYBRqPCRMix（東洋紡生物科技日本有限公司）。實驗中所用引物均來自于試劑盒本身附帶或由Sangon公司合成，所有測序均由南京金斯瑞公司測序儀完成。

1.2方法

1.2.1目的基因克隆

用E.Z.N.ATotalRNAKitI試劑盒從草魚腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腸、卵巢、精巢等組織分離出總RNA，用RevertAidFirst-Strandc.DNASynthesisKit試劑盒以oligo-dT-3'Adaptor為引物合成cDNA的第一條鏈，根據已知草魚的FSHR和LHR的開放閱讀框序列，用PrimerPrimeier5.0軟件設計FSHR和LHR特異性引物，用嵌套式PCR提高其特異性。3'RACE的特異引物為正向引物。

PCR擴增程序按如下程序進行：94～95T預變性3-5min；94-95℃，0.5-2min；37-70℃；，0.5～2min；70-750.5-1min；25-35個循環，最后70-75℃延伸5-10min。按UNIQ-10柱式DNA膠回收純化試劑盒說明書進行PCR產物的純化回收。將回收產物連接到PMD18-T載體上，將連接產物轉化到DH5α感受態細胞中，挑取陽性克隆進行培養，提取質粒進行酶切鑒定，由南京金斯瑞公司測序，測序結果通過與引物拼接后，在NCBI上的BLAST（httpy/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進行同源性物種比對，沒有堿基差異，確定克隆序列為目的序列。

1.2.2系統進化分析

從GenBank中搜索日本鰻鱺、非洲鯰魚、斑馬魚、大西洋鮭、斜帶石斑魚、西氏擬隆頭魚、牙漢魚、小家鼠musculus）、雞（Gallusgallus）和人（homosapiens）的GTHR序列，運用MEGA6.0軟件以N-J法根據不同物種構建出FSHR和LHR的系統進化樹。

1.2.3LHR和FSHR在草魚成體不同組織的表達分析

將提取的腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腸、卵巢、精巢等組織材料質量較好的RNA，按照1.2.1的步驟進行反轉錄過程，只需把3sitesAdaptorPrimer換成Oligo（dt）。以β-actin為內參作對照，按照1.2.1的反應條件和反應體系擴增表1的特異性引物后電泳檢測。然后采用ABI7900HTReal-timePCRSystems進行熒光定量PCR，反應程序為95℃，2min；95℃，10min，之后進行30個循環（95℃，15s，60℃，45s）。設置在60℃，45s退火這一過程收集熒光。利用Livark等[17]提出的相對標準曲線法，對相對定量（relative quantification，RQ）結果數據進行分析，并用溶解曲線法檢測PCR引物結合的特異性。

1.2.4LHR和FSHR在草魚各發育時期的表達分析

將通過波恩試劑固定的卵巢材料進行鑒定后，取Ⅱ、Ⅲ、V期的雌性草魚卵巢組織RNA，用RevertAidFirst-StrandcDNASynthesisKit試劑盒以Oligo（dT）18為引物合成cDNA的第一條鏈，根據已知草魚的FSHR和LHR的開放閱讀框序列設計合成Real-timePCR引物，引物如表2所示。然后再按照1.2.3的過程做Real-timePCR。

2結果與分析

2.1RACE擴增結果

提取草魚性腺組織的總RNA，以反轉錄形成的CDNA為擴增模板，根據已知草魚的FSHR、LHR的開放閱讀框序列，用PrimerPrimeier5.0軟件分析設計特異性引物，通過2次嵌套式PCR擴增出FSHR的3'端序列，結果如圖1所示，其片段大小為390bp，在NCBI上經過Blast對比和同源性分析，證實獲得的目的序列為草魚促濾泡素激素受體FSHR的3'末端序列（草魚FSHR在GenBank搜索序列號為KJ742829）。

2.2FSHR和LHR的系統進化分析

根據不同物種構建出的FSHR和LHR的NJ系統進化樹分別如圖2和圖3所示，結果表明，草魚的FSHR與斑馬魚、非洲鯰魚的相似性最高，草魚的LHR與斑馬魚的相似性最高。

2.3LHR和FSHR在草魚成體不同組織的表達分析

草魚的腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腸、卵巢、精巢組織的總RNA提取結果如圖4所示，以反轉錄形成的各組織cDNA為模板進行RT-PCR擴增，結果顯示草魚GTHR在腸、腎臟和性腺組織中特異性表達，如圖5所示。

運用相對定量PCR技術比較LHR和FSHR在草魚各組織中的特異性表達量，結果如圖6和圖7所示：在腸、腎臟、卵巢和精巢組織中特異性表達量分別為1、1.050、69.264和54.278；FSHR在肝臟、腎臟、卵巢和精巢組織中特異性表達量分別為1、1.105、68.788和60.368。數據顯示在草魚的腸、腎臟和卵巢和精巢組織中LHR的特異性表達量和草魚肝臟、腎臟和卵巢和精巢組織中FSHR的特異性表達量相近，且LHR和FSHR在性腺組織中的表達量均遠高于其他組織中的表達量。

2.4LHR和FSHR在草魚卵巢不同發育時期的表達分析

運用相對定量PCR技術分析LHR和FSHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢組織中的特異性表達量，結果如圖8所示：LHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢組織中特異性表達量分別為1、5.500、40.278；FSHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢組織中特異性表達量分別為1、8.688、58.368。結果表明LHR和FSHR的特異性表達量隨著性腺的發育而不斷增加，此外，兩者在V期的卵巢組織中的特異性表達量明顯高于Ⅱ、Ⅲ期卵巢組織中的特異性表達量，并且FSHR在卵巢組織中的特異性表達量比LHR高。

總之，本研究成功地克隆出了草魚的FSHR和LHR基因。對組織表達特異性的RT-PCR的分析表明，草魚的LHR在精巢、卵巢、腎臟和心臟組織中有表達，FSHR在精巢、卵巢、腎臟和腸組織中有表達，并且兩者在性腺組織內的表達量比其他組織高很多，在對人類胚胎和成體時期的研究中也有關于LHR在性腺外的組織表達的記錄，這說明促性腺激素受體可能對除性腺以外的組織有一定的作用[18]。該結果為進一步研究促性腺激素受體對非性腺組織的影響以及這種影響引起的生理意義奠定了基礎。實時定量PCR分析表明了FSHR和LHR在草魚卵巢組織中的特異性表達量隨著卵母細胞的發育逐漸增高，并且在卵巢組織中的特異性表達量比LHR高。LHR和這種時空表達模式與其他魚類在性腺組織中的表達是平行的這對于研究其他魚類的表達模式具有一定的參考作用。系統進化分析表明草魚與斑馬魚相似性最近，與其他魚類的相似性也高于人、小家鼠和雞，這與形態學上的系統進化分析是一致的。

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