耐甲氧西林金黃色葡萄球菌小鼠腹膜炎模型的建立

孫琦 王湘雨 陳詩琪 司徒莉芳 趙衛(wèi) 萬成松

摘要：“超級細(xì)菌”耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin inresistantStaphylococcusaarews，MRSA）是誘發(fā)連續(xù)腹膜透析患者腹膜炎的常見細(xì)菌，且治療困難。目前缺少MRSA腹膜炎動物模型。腹腔注射2x109?2x1010CFU/mL7組不同濃度的MRSA感染小鼠，觀察小鼠死亡時間，測定肝臟與脾臟細(xì)菌定植量，進(jìn)行肝、脾病理分析，確定適宜的建模濃度。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染細(xì)菌濃度最小致死劑量為每只2x109CFU，最適建模濃度為每只1.4x109CFU。結(jié)果表明建立了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌小鼠腹膜炎模型，為MRSA致腹膜炎的致病機制研究、疫苗的研制提供實驗基礎(chǔ)

關(guān)鍵詞：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）；腹膜炎；小鼠模型

中圖分類號：R-33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）01-0054-05

EstablishmentofMousePeritonitisModelofMethicillinResistant Staphylococcus aureus

SUNQi，WANGXiang-yu，CHENShi-qi，SITULi-fang，ZHAOWei，WANCheng-song*

（BSL-3Laboratory，SchoolofPublicHealthandTropicalMedicine，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，Guangdong，China）

Abstract："Superbacteria11methicillinresistantStaphylococcusaureus（MRSA）isafrequentcauseofperi?tonitisincontinuousperitonealdialysis，andthetreatmentisdifficult.Meanwhile，MRSAperitonitisanimalmodelsarelacking.Itwasperformedwithmicedividedintosevengroupsandgivenintraperitonealinjection2x109?2x1010CFU/mLofMRSA.Atthesametime，thetimeofdeathwasrecorded.Besides，thebacteriaamountofliverandspleenwasmeasuredandthepathologicalanalysisofliverandspleenwasperformed.Thenappropriatemodelingconcentrationwasdetermined.TheresultsshowedthattheminimallethaldoseoftheclinicalisolatedMRSAwas2x109CFUeachmouseandtheoptimalconcentrationofmodelingwas1.4x109CFUeachmouse.Themouseperitonitismodelofmethicillin-resistantstaphylococcusaureuswasconstruct?edsuccessfully，whichprovidedareliableanimalmodelfortheresearchofperitonitiscausedbyMRSAanddevelopmentofthevaccine.

Keywords：methicillinresistantStaphylococcusaureus（MRSA）；peritonitis；mousemodel

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：054?058）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinre?sistantStaphylococcusaureus，MRSA）自1961年在英國首次發(fā)現(xiàn)，全球范圍內(nèi)均有廣泛報道。近年來由于抗生素的廣泛使用，MRSA的分離率逐年增加，已成為醫(yī)院感染最常見的致病菌[1、2]。由于MRSA耐藥譜廣、感染率高、病情嚴(yán)重、治療困難，且多重耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，一般只對萬古霉素敏感，所以MRSA被稱為“超級細(xì)菌”[3]。MRSA可引起菌血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎等，同時也可導(dǎo)致腹膜炎[4]。由MRSA引起的腹膜炎主要發(fā)生在腹膜透析治療中，腹膜透析是一種治療急、慢性腎功能衰竭的重要方法，腹膜炎為其主要并發(fā)癥，在腹膜透析腹膜炎患者中常可分離到MRSAI目前國內(nèi)外缺少MRSA腹膜炎動物模型。本實驗中用不同濃度的MKSA菌液腹腔注射小鼠，篩選建立耐甲氧西林金黃色葡萄球菌小鼠腹膜炎模型，為進(jìn)一步研究MRSA致腹膜炎疾病提供了實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA臨床分離株，由南方醫(yī)院檢驗科分離，本實驗室保存。對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和含酶抑制劑的復(fù)方制劑耐藥。

1.2實驗動物

SPF級昆明種小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗過程中供給專用飼料及飲水，所有的試驗程序符合美國NIH（NationalInstitutesofHealth）有關(guān)動物保護(hù)和利用的條例。

1.3菌株OD600-CFU標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

MRSA臨床分離株復(fù)蘇，37℃200r/min搖菌過夜，取菌液，LB固體培養(yǎng)基劃線，37℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落，再搖菌培養(yǎng)12h。

取搖菌后菌液增菌培養(yǎng)（1：100），2h后，取菌液測OD600，之后每0.5h測一次OD600，當(dāng)OD600大于1時，停止測量。每次測量，取菌液1mL，離心棄上清，用無菌生理鹽水洗滌2次，用1mL無菌生理鹽水重懸。當(dāng)大于1時，停止測量。

將重懸后的菌液倍比稀釋（1：10）10次，每份稀釋液1mL，取各稀釋濃度0.1mL，加入無菌平皿后，倒入已熔化的LB培養(yǎng)基（45℃），與菌液混勻，待冷卻凝固后，37℃培養(yǎng)24h，菌落計數(shù)。同一稀釋濃度制兩塊平板。計算原菌液單位體積細(xì)菌數(shù)，其對數(shù)值lgCFU與稀釋液對應(yīng)的OD600值建立OD600-CFU標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4感染菌液的制備

將小鼠隨機分為8組，組號分別為1～8，每組10只小鼠。1～7組為實驗組，第8組為空白對照組。

取MRSA臨床分離株，過夜培養(yǎng)后，增菌培養(yǎng)（1：100）3h，測定OD600，根據(jù)OD600-CFU標(biāo)準(zhǔn)曲線確定菌液內(nèi)活菌濃度，離心后棄上清，用無菌生理鹽水洗滌2～3次再重懸，調(diào)整菌液濃度為2x109CFU/mL、6x109CFU/mL、8x109CFU/mL、1.2x1010CFU/mL、1.4x1010CFU/mL，1.8x1010CFU/mL、2x1010CFU/mL。

1.5MRSA腹膜炎小鼠模型的建立

將小鼠隨機分為8組，組號分別為1～8，每組10只小鼠。1～7組為實驗組，第8組為空白對照組。注射前12h禁食，自由飲水。

1-7組小鼠經(jīng)腹腔分別注射2x109CFU/mL、6x109CFU/mL、8x109CFU/mL、1.2x109CFU/mL，1.4x1010CFU/mL、1.8x1010CFU/mL，2x1010CFU/mL的菌液每只0.1mL，第8組空白對照組每只注射0.1mL無菌生理鹽水。實驗后將小鼠放回籠內(nèi)，給予食物及飲水。

1.6MRSA腹膜炎小鼠模型的評估

小鼠生存率：小鼠感染MRSA后分別于2h、4h、6h、8h、10h、16h、24h、48h、72h、95h、120h觀察，記錄小鼠死亡情況，繪制各感染濃度120h內(nèi)小鼠生存曲線。

病理學(xué)檢查：小鼠感染MRSA后，第24h、72h、120h頸椎脫臼處死，取肝臟與脾臟，生理鹽水清洗，浸人4%多聚甲醛溶液中固定，H.E染色，顯微鏡下觀察。正常小鼠做空白對照。

器官帶菌量測定：感染MRSA小鼠，每24h取一只，頸椎脫臼處死，取肝臟與脾臟，研磨勻漿，倍比稀釋（1：10）4次，取0.1mL稀釋液加入無菌平皿，倒入已熔化LB培養(yǎng)基（45℃），混勻，培養(yǎng)基冷卻凝固后，37℃培養(yǎng)24h，菌落計數(shù)。計算肝、脾細(xì)菌定植量。

2結(jié)果

2.1菌株OD600-CFU標(biāo)準(zhǔn)曲線

2h、2.5h、3h、3.5h測定菌液OD600，分別為0.185、0.576、0.929、1.256。活菌計數(shù)實驗中，2h、2.5h、3h、3.5h菌液的第7次稀釋濃度的平均菌落生長數(shù)分別為5.5個、17個、26個、36.6個。

每毫升菌液活菌數(shù)=平均菌落生長數(shù)x稀釋倍數(shù)x10，計算得2h、2.5h、3h，3.5h菌液細(xì)菌量為5.5xlO8CFU/mL，1.7xlO9CFU/mL>2.6xlO9CFU/mL、3.65xl09CFU/mL。以O(shè)D600值為橫坐標(biāo)，以lgCFU為縱坐標(biāo)，繪制菌株OD600-CFU標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

2.2感染后小鼠癥狀

不同劑量MRSA感染小鼠后，1組小鼠精神尚可，無明顯變化。2～3組小鼠精神稍差，活動減少，于16h開始出現(xiàn)死亡，死前出現(xiàn)驚厥抽搐等表現(xiàn)，24h后小鼠存活率穩(wěn)定。4?7組小鼠精神狀態(tài)差、蜷縮不動、厭食、毛發(fā)雜亂蓬松、眼部充血，于8h開始出現(xiàn)死亡，死前出現(xiàn)驚厥抽搐等表現(xiàn)，24h后仍不斷有小鼠死亡。空白對照組小鼠精神食欲等無明顯變化。

2～7組未死亡小鼠于感染后體重下降，72h體重降至最低，%h開始回升。1組與空白對照組小鼠體重持續(xù)增加。

2.3小鼠生存率

小鼠注射不同劑量MRSA菌液，低濃度組小鼠無死亡，隨著MRSA菌液濃度增加，小鼠死亡率不斷升高。當(dāng)菌液濃度達(dá)到1.4x1010CFU/mL時，24h小鼠死亡60%，120h小鼠全部死亡，認(rèn)為該濃度適合建立小鼠模型。當(dāng)菌液濃度達(dá)到2x1010CFU/mL時，小鼠在24h內(nèi)全部死亡，每只小鼠注射0.1mL菌液，則該菌株的最小致死劑量為每只2x109CFU（圖2）。

由圖2可見，小鼠注射菌液后，第1組小鼠無死亡；第2組小鼠24h內(nèi)死亡1只，至120h無新增死亡數(shù)；第3組小鼠24h內(nèi)死亡2只，至120J，無新增死亡數(shù)；第4組小鼠24h內(nèi)死亡4只，至120h共死亡8只小鼠；第5組小鼠24h內(nèi)死亡6只，至120h10只小鼠全部死亡；第6組小鼠24h內(nèi)死亡7只，至120h全部小鼠死亡；第7組小鼠24h內(nèi)全部死亡?？瞻讓φ战M小鼠無死亡。

2.4病理學(xué)檢查

以1.4x1010CFU/mL濃度MRSA感染小鼠，于24，72，120h解剖小鼠并觀察，可見小鼠腹腔有滲出液，腹膜不光滑、粘連，部分小鼠可見腹腔內(nèi)有膿腫物形成。取小鼠肝臟與脾臟，H.E染色制作病理切片，顯微鏡下觀察。鏡下可見在24h～120h期間內(nèi)，肝、脾組織漸進(jìn)性壞死，細(xì)胞逐步出現(xiàn)變性壞死，組織結(jié)構(gòu)溶解消失。24h鏡下未見炎性細(xì)胞，72h與120h可見中性粒細(xì)胞浸潤。24h肝臟與脾臟可見大量細(xì)菌團(tuán)塊，72h與120h細(xì)菌團(tuán)塊明顯減少消失。

MRSA感染小鼠24h肝臟病理切片鏡下觀察，肝組織結(jié)構(gòu)較空白對照組變化不明顯，肝血竇小血管中以及肝實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見大量細(xì)菌團(tuán)塊，未見炎性細(xì)胞浸潤。72h肝臟病理切片可見肝組織局部出現(xiàn)點狀壞死，核固縮，肝細(xì)胞腫大，可見炎細(xì)胞聚集。120h肝臟病理切片可見肝組織結(jié)構(gòu)消失，破壞明顯，未見明顯肝索，肝細(xì)胞明顯腫大，胞質(zhì)疏松，可見散在肝細(xì)胞氣球樣變性，脂肪樣變性。局部可見碎片狀壞死，核固縮，核溶解明顯，可見中性粒細(xì)胞浸潤。圖3A、B、C分別為第24h，72h、120h切片。

MRSA感染小鼠24h脾臟病理切片鏡下觀察，可見脾組織結(jié)構(gòu)局部溶解消失，脾組織內(nèi)存在大量細(xì)菌團(tuán)塊。72h脾臟病理切片可見睥組織壞死明顯，出現(xiàn)空洞結(jié)構(gòu)，可能為巨噬細(xì)胞吞噬作用造成。120h脾臟病理切片可見脾組織結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞松散，炎性細(xì)胞浸潤。圖4A、B、C分別為第24h、72h、120h切片。

2.5器官帶菌量測定

以8x109CFU/mL（第3組）、1.4x1010CFU/mL（第5組）、2x1010CFU/mL（第7組）濃度菌液感染小鼠，小鼠肝臟與脾臟均有細(xì)菌定植，在感染24h后定植菌量達(dá)到高峰，之后數(shù)日不斷下降。對照組小鼠肝臟與脾臟均無細(xì)菌定植。見圖5與圖6。

3討論

由于近年來抗生素的濫用，MRSA的檢出率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，已成為醫(yī)院最常見的致病菌之一[1、2]，MRSA感染率高，感染后病情兇猛，不及時治療有很大的死亡風(fēng)險[3]。而MRSA耐藥譜廣且多重耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，一般只對萬古霉素敏感[3]，甚至近年來發(fā)現(xiàn)對萬古霉素耐藥的MRSA[6]，這無疑增加了MRSA感染的治療難度，可見研制新型藥物治療MRSA感染的緊迫性與必要性。而研制MRSA的致病機理及其治療藥物，首先需要建立其感染動物模型，目前，國內(nèi)外建立的MRSA小鼠模型主要分3種：膿毒血癥全身感染模型、局部損傷模型如皮膚膿腫感染模型、肺部感染模型[7]。國外有學(xué)者建立了金黃色葡萄球菌小鼠腹膜炎模型[8]，但缺少MRSA小鼠腹膜炎模型。實際上，小鼠急性細(xì)菌性腹膜炎模型是臨床研究的經(jīng)典的動物模型之一，且MRSA亦會引起細(xì)菌性腹膜炎的發(fā)生：肝硬化患者由于腹水的產(chǎn)生易發(fā)生由MKSA引起的自發(fā)性腹膜炎[9]，肝移植等腹部手術(shù)后引起感染性腹膜炎[10]，而由MRSA感染引起的細(xì)菌性腹膜炎最常發(fā)生在終末期腎臟疾病與連續(xù)腹膜透析患者中[5]。腹膜透析作為晚期腎衰竭病人常用的治療手段之一，由于其破壞了皮膚屏障功能，且腹膜導(dǎo)管缺乏免疫作用，故常在其出口處發(fā)生細(xì)菌感染，引發(fā)腹膜透析主要的并發(fā)癥——腹膜炎[11]。最常見的導(dǎo)致腹膜透析相關(guān)腹膜炎的細(xì)菌是革蘭陽性細(xì)菌，尤其是抗生素耐藥的革蘭陽性細(xì)菌正越來越普遍地成為腹膜透析相關(guān)腹膜炎的致病菌數(shù)據(jù)顯示，1994?2005年間，香港進(jìn)行腹膜透析治療的2065個病例中，245個病例發(fā)生了腹膜炎（11.9%）：由金黃色葡萄球菌引起的腹膜炎有152例，占其中的62.4%，由MRSA引起的腹膜炎有45例，占所有腹膜炎病例的18.4%[13]。且MRSA引起的腹膜炎治愈率僅有7.7%，遠(yuǎn)低于其他細(xì)菌所致腹膜炎的治愈率[5]。對MRSA腹膜炎的致病機制及藥物研究刻不容緩，而動物模型是研究的基礎(chǔ)，因此建立MRSA小鼠腹膜炎模型是非常有必要的。

本實驗中，我們對小鼠腹腔注射7個不同濃度的菌液以誘發(fā)小鼠腹膜炎，其中第1組小鼠5日內(nèi)無死亡，說明該感染濃度過低，不足以引起小鼠腹膜炎的發(fā)生；第7組小鼠24h內(nèi)全部死亡，故該組小鼠每只的注射劑量2x109CFU，是這株MRSA菌株的最小致死劑量（minimallethaldose，MLD）?？紤]到小鼠模型常用于評價藥品的藥效，故感染的菌液濃度過低，小鼠死亡數(shù)過少體現(xiàn)不出藥物的作用，而感染濃度過高，小鼠很快全部死亡，藥物難以起保護(hù)作用，亦觀察不到藥物作用。而第5組1.4x1010CFU/ml組小鼠24h內(nèi)死亡6只，達(dá)到了總數(shù)的半數(shù)左右，至第5日10只小鼠全部死亡，故以該濃度菌液感染小鼠后再用藥物進(jìn)行保護(hù)，可以明顯地觀察到藥物的保護(hù)效力，故認(rèn)為該濃度感染的小鼠建模最為合適。

本實驗中，我們觀察到小鼠在感染高濃度MRSA后，體重下降，之后逐漸回升。小鼠有典型的急性腹膜炎表現(xiàn)，解剖小鼠檢查肝臟與脾臟發(fā)現(xiàn)，肝臟與脾臟呈漸進(jìn)性損害，感染MRSA120h后細(xì)胞損害嚴(yán)重且有炎性細(xì)胞浸潤，主要為中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞對小鼠肝臟與脾臟進(jìn)行細(xì)菌定植量測定，發(fā)現(xiàn)感染24h時有大量細(xì)菌定植，之后細(xì)菌量逐步下降。以上表現(xiàn)符合細(xì)菌性腹膜炎的臨床與病理表現(xiàn)。

MRSA小鼠腹膜炎模型的建立，為今后MRSA致腹膜炎疾病的致病機制的研究、治療MRSA腹膜炎疾病的藥物藥效評價以及疫苗的研發(fā)等奠定了實驗技術(shù)基礎(chǔ)。

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