AChE在Tn+人白血病Jurkat細胞中的表達狀況研究

孫旭紅 于曉鋒 李乃坤 杜鎮鎮 李笑 胡濤

摘要：通過研究Tn+人白血病Jurkat細胞中AChE的表達狀況，可以分析Jurkat細胞AChE表達與Tn抗原表達水平的關系，從而為AChE用于腫瘤的預后判斷或臨床治療提供實驗依據。本論文利用ELISA、色度法試驗在蛋白水平分析了AChE的表達狀況，利用RT-PCR以及Real-timePCR試驗在mRNA水平分析了AChE的表達狀況結果顯示：Jurkat細胞中AChE的含量及活性明顯低于Tn-的白血病細胞K562，且二者又均低于正常白細胞由此認為，人白血病細胞中AChE的含量及活性低于正常細胞，AChE的表達與Tn-抗原的表達水平呈負相關，為腫瘤的臨床判斷提供了有力的依據.

關鍵詞：AChE；Tn抗原；腫瘤；JurkatT

中圖分類號：R730.3 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）01-0034-05

StudyontheExpressionProfileofAChEinLeukimiaCellLineJurkatTWhichisTnAntigenPositive

SUNXu-hong1，YUXiao-feng1，LINai-kun2，DUZhen-zhen1，LIXiao-yan1，HUTao1"

（1.CollegeofBasicSciences，BinzhouMedicalUniversity，Yantai264003，Shandong，China；2.AffiliatedHospitalofBinzhou MedicalUniversity，Binzhou256603，Shandong，China）

Abstract：ToanalyzetherelationshipbetweentheexpressionofAChEandTnantigeninhumanleukimiacelllineJurkatTbystudyingtheexpressinglevelandactivityofacetylcholinesterase（AChE）inthesecells，whichwillprovideexperimentalevidencesaboutusingAChEtotreattumorandevaluateitsprognosis.The.studyanalyzedtheproteinactivityandcontentofAChEusingELISAandColorimetrictest，aswellasexam?inedthemRNAexpressionlevelbyRT-PCRandReal-timePCRassayinJurkatcells.TheresultsshowedthatthecontentandactivityofAChEinJurkatcells，whichwereTnantigenpositive，significantlylowerthanthatinhumanleukimiacelllineK562，whichwasTnantigennegative.Andbothofthemwerelowerthanthatinnormalwhitebloodcells.Therefore，theconclusionwasthatthecontentandactivityofAChEinhumanleukimiacellswerelowerthanthatinnormalwhitebloodcells.Therewasanegativecorrelationbe?tweentheexpressionlevelofAChEandTnantigen.Theresultswillprovidestrongsupporttodeterminetheclinicprognosisoftumor.

Keywords：AChE；Tnantigen；tumor；JurkatT

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：034～038）

乙酸膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是中樞和外周膽堿能神經系統的重要組成成分，其經典的生物學功能是在神經突觸間隙滅活神經遞質乙酰膽堿（acetylcholine，ACh），達到終止神經沖動的目的。近年來的研究表明，AChE的表達并不局限于膽堿能神經系統，在許多非神經組織，諸入內皮細胞、上皮細胞、間皮細胞、免疫細胞、某些腫瘤細胞以及腫瘤組織，亦有不同程度的表達[1]；并與細胞間的粘附、信號傳遞、細胞增殖分化以及細胞凋亡有關[2]。研究發現AChE可以通過滅活絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K/AKI），活化糖原合成激酶GSK3/3（glycogensynthesiskinase-3，GSK-3）等途徑抑制腫瘤細胞的增殖[3]，誘導細胞凋亡，AChE是一種新的凋亡調控因子[4]。在表達AChE的腫瘤組織中，AChE表達越高，病人預后越好；AChE甚至被認為可以單獨作為腫瘤預后的重要標志[5]。抗原是一種常見的腫瘤相關抗原，其表達水平與腫瘤組織的TNM分期有關[6、7]，與腫瘤的預后有關[8]。為徹底弄清Tn+腫瘤細胞中AChE表達狀況，本文以JurkatT、K562及正常人白細胞（whitebloodcell，WBC）為研究對象，采用ELISA、色度法檢測AChE的蛋白含量及水解活性；并提取RNA，通過RT-PCR、Real-timePCR克隆擴增AChEcDNA，進一步確定AChEmRNA的表達水平。分析探討AChE與Tn抗原之間的關系，進一步明確AChE在Tn+細胞中的生物學作用。

1材料與方法

1.1細胞來源

Tn+細胞JurkatT與Tn-細胞K562由薛江楠博士惠贈，本室傳代保存；正常人外周血WBC作為正常對照。

1.2主要試劑

人外周血白細胞分離液（Solarbio公司，中國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術公司）；人乙酰膽堿酯酶ELISA試劑盒（K&D，北京奇松生物科技有限公司）；anti-TnIgMMcAb為巨同忠博士惠贈（SantaCruz公司，美國）；羊抗鼠lgM-FITC（SantaCruz公司，美國）。

1.3儀器設備

倒置顯微鏡IX-70（日本Olympus公司）；生物安全柜（上海力康公司）；冷凍離心機（ST16R，美國賽默飛世爾科技公司）；漩渦混合器（VWR230，美國VWR公司）；全波長酶標儀（TecanM1000，瑞士帝肯公司）；Real-timePCR儀（Rotor-Gene-3000，澳大利亞Corbett公司）；FACSCalibur流式細胞儀（BectonDickinson公司，美國）。

1.4Tn+、Tn-細胞培養和正常人白細胞分離

人類T淋巴瘤細胞系JurkatT和慢性髓原白血病細胞株K562于含10%FBS的RPMI1640（Hyclone）培養，37°C5%CO2培養72h，直接收集備用。正常人5mL肝素抗凝血，按人外周血門細胞分離液試劑說明分離白細胞，使用時用PBS懸起。

1.5超聲提總蛋白

收集3種細胞懸液，離心、棄上清，重懸于2mL預冷的TBS緩沖液中，1200r/min，4℃離心10min；棄上清，冰浴上加入TBS緩沖液1mL、蛋白酶抑制劑10pL；超聲時間2min，停1min，5個循環，700g，4℃離心10min；吸取上清于EP管內，加入0.5%TritonX-100，冰浴30min；按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測樣品的總蛋白濃度。

1.6AChE活性測定

利用乙酰膽堿酯酶催化硫代底物出現顯色反應來測定AChE活性。96孔板，每孔加入0.1tnol/LPBS50μL，超聲提取的蛋白樣品10μL、10mmol/LS-AchI30μL，充分混勻，放入37℃培養箱內孵育5min或15min；加入1mol/LHC110μL，震蕩混勻，終止反應；10min后加0.03%DTNB200μL，總體積300μL，震蕩混勻；5min后酶標儀上405nm波長處測0D值；15min后405nm測OD值，15minOD值減去5min0D值，求得□A；根據公式AChE（U/mL）=AA/minx0.3/（13.6x0.01x1），再除以相應蛋白濃度，求出AChE活性。

1.7ELISA測AChE蛋白表達量

應用雙抗體夾心法，具體步驟按照ELISA試劑盒（R&D）說明書進行操作。

1.8總RNA提取

按照Trizol試劑盒（Invitrogen）提取細胞總RNA，-80℃保存備用。

1.9RT-PCR1.9.1引物設計

根據NCBI數據庫檢索AChE、GAPDH基因的cDNA序列，用PrimerExpress2.0軟件設計，由上海碩世生物科技有限公司合成（表1）。

1.9.2cDNA合成與PCR反應

逆轉錄體系20m-L：TotalRNA1|j.g，Oligo（dt）Primer（2.5μmol/L）1μL，RNaseFreewater適量，定量至總體積13μL。65°C，10min，立即置于冰上，靜置2min，加入5xRTBuffer4μL，dNTPMix-ture（各10mmol/L）2μL，RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，ReverTraAce（20U/（μL）0.5μL。55℃孵育30min，85℃加熱5min，-20℃保存備用。PCR反應體系20μL：qPCRMasterMix（2x）10μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA模板1μL，DD Water7μL；PCR反應條件：95℃預變性3min；30x（95℃，30s；57°C，30s；72°C，30s），72℃延伸1min。PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

1.10 Real-timePCR

1.10.1引物設計

引物序列用PrimerExpress2.0軟件設計，由上海碩世生物科技有限公司合成（表2）

1.10.2基因水平的定量檢測

采用FAM熒光探針法，GAPDH作為內參，Real-timePCR反應體系20μL：qPCRMasterMix（2x）10μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，熒光探針（10μmol/L）0.5μL，cDNA模板1-2μL，DDWater加至20μL，每一樣品做3個復孔；Real-timePCR反應條件：40x（95℃，5min；95℃，10s，55°C，40s，72℃，1min）。

1.11 統計學處理

本文中的所有數據均應用SPSS統計軟件作統計學處理，多組間兩兩比較采用Krnskal-WallisH檢驗，P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1Tn抗原的表達狀況

流式細胞儀檢測結果顯示，白血病細胞系JurkatT表達Tn抗原（圖1A）；白血病細胞K562與正常WBC不表達Tn抗原（圖1B、C）。

2.2AChE在蛋白水平的表達分析

Tn+細胞（JurkatT）AChE活性與Tn-細胞（K562，正常對照WBC）相比，活性明顯下降；Tn-細胞之間，即K562與正常WBC的AChE活性相比，K562明顯低于正常WBC（n=5，P<0.01，圖2A）。ELISA試劑盒檢測AChE表達水平，結果顯示Tn+細胞（JurkatT）與Tn-細胞（K562，正常對照WBC）相比，AChE蛋白含量明顯下降；K562與正常WBC相比，K562明顯低于正常WBC（n=5，P<0.01，圖2B）。

2.3AChE在轉錄水平的表達分析

采用RT-PCR、Real-timePCR方法，以GAPDH為內參，比較JurkatT、K562和WBC目的基因的相對mRNA的表達水平（見圖3A、B），結果顯示：JurkatT細胞AChEmRNA水平明顯低于K562和WBC；K562與正常WBC相比，K562AChEmRNA水平低于正常WBC。

3討論

AChE是催化水解乙酰膽堿為膽堿和乙酸，恢復突觸后膜極化的酶，在傳遞神經沖動的過程中起重要作用。近期研究發現AChE不僅局限于中樞和外周神經系統，在一些非神經組織和器官，如上皮組織、血細胞等中也有存在[9]。更值得注意的是，AChE的表達異常與多種腫瘤的發生、發展及預后有關。包括神經系統腫瘤例如星形膠質細胞瘤[10]和非神經系統的腫瘤，如乳腺癌[11]、肝癌[3]、結腸癌等。Tn抗原是腫瘤相關抗原，人類70%～80%的癌癥組織，包括乳腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮膚癌均可檢測到Tn抗原的表達，并且Tn抗原的表達與腫瘤的發生、發展、轉移及預后密切相關[12]。

盡管已在多種類型的腫瘤細胞中發現了AChE的表達水平較正常細胞偏低[13、14]，但是在Tn+的腫瘤細胞中AChE的表達水平如何未見報道我們分別從基因及蛋白水平研究AChE在正常白細胞及白血病細胞的表達狀況。發現白血病細胞JurkatT及K562中AChE的活性及含量均低于正常白細胞，而JurkatT細胞中AChE的活性及含量明顯低于K562細胞。更值得注意的是JurkatT細胞表達Tn抗原，但K562細胞不表達Tn抗原。

總之，我們首次提出在人白血病細胞中AChE的表達及活性與Tn抗原的表達成負相關。目前研究認為腫瘤細胞中Cosmc基因異常導致T-synthase折疊錯誤，糖基化途徑異常致Tn抗原的表達AChE基因位于人類7號染色體上（7q22），白血病、卵巢癌和乳腺癌AChE7q22染色體缺失，骨髓增生異常綜合征、急性髓樣白血病AChE基因拷貝數量改變，肺癌組織中AChE糖基化異常。AChE經過連接糖基化、適當折疊盤曲才能形成有活性的AChE，缺乏糖基化修飾的AChE活性下降臣多在內質網降解；AChK3個糖基化位點上（AChETN296Q、AChh：TN381Q、AChETN495Q）任一位點的突變體及3個位點同時突變的突變體（A-ChETN296Q/N381Q/N495Q）轉染目的細胞，AChE活性有不同程度的下降，AChETN381Q、AChE-TN296Q/N381Q/N495Q尤為明顯[16、17]。因此AChE基因轉錄水平及轉錄后修飾的異常可能是影響AChE表達的主要原因：這與我們發現的膜糖蛋白糖基化異常導致腫瘤細胞表達Tn抗原，似乎存在某種關聯與Tn-腫瘤細胞相比，Tn+的腫瘤細胞中AChE的基因是否有異常，Tn+的腫瘤細胞中AChE對腫瘤細胞的增殖及凋亡的影響如何還有待進一步研究。

4展望

我們研究發現在白血病細胞中，AChE的表達與Tn抗原的表達呈負相關。有研究表明，雖然在結腸癌細胞中AChE的表達量較正常細胞低，但在不表達Tn抗原的結腸癌細胞系Caco-2中AChE過表達。提示可能在結腸癌細胞中Tn抗原的表達與AChE的表達也存在負性相關的關系：有關Tn抗原及AChE在腫瘤細胞中異常表達的機制研究均有相關報道。但在Tn+的腫瘤細胞中，AChE表達量及活性降低的機制尚不清楚，可能Tn抗原的表達影響了AChE的代謝和信號轉導的相關蛋白。在其他Tn+的腫瘤細胞及組織中是否也存在AChE的表達異常仍待深人研究明確Tn抗原與AChE在腫瘤細胞中表達之間的關系，有助于全面了解AChE及Tn抗原的生物學功能，認清Tn抗原及AChE異常表達的病理學意義，為腫瘤的診斷、治療及預后提供新的實驗依據，為以Tn抗原或AChE為靶點治療腫瘤制定新策略。

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