丹參酮IIA對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡的作用

虞建新，吳　奇，楊　歡(九江學院附屬醫院內分泌科，江西九江332000)

丹參酮IIA對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡的作用

虞建新△，吳奇，楊歡
(九江學院附屬醫院內分泌科，江西九江332000)

［摘要］目的:觀察丹參酮IIA對高糖刺激人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響，并探討相關的作用機制。方法:四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞存活率;流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染法定量檢測內皮細胞凋亡情況;免疫印跡法檢測抗凋亡分子Bcl-2、促凋亡分子Bax以及細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)的蛋白表達水平。結果:丹參酮IIA可抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞存活率的減少以及凋亡率的增加。此外，丹參酮IIA處理后，Bcl-2蛋白表達顯著增加，Bax蛋白表達顯著減少，并且線粒體Cyt C釋放受到明顯抑制。結論:丹參酮IIA可以通過調節線粒體凋亡信號通路相關蛋白表達而對抗高糖誘導內皮細胞的凋亡。

［關鍵詞］丹參酮IIA;高糖;內皮細胞;細胞凋亡

血管內皮細胞是一層介于血流和血管內側之間的縱向細胞［1］。內皮細胞的結構和功能完整是維持血管內環境穩定關鍵因素。已有研究表明，在如高血壓、動脈粥樣硬化以及糖尿病等一系列心血管疾病當中，均可觀察到內皮細胞數量明顯減少，其功能亦受到明顯的損害［2-3］。

丹參酮IIA(tanshinone IIA，Tan IIA)是中國傳統中藥丹參的主要有效成分之一，具有脂溶性，其可抑制平滑肌細胞增殖、抑制血小板聚集和擴張冠脈血管及抗炎作用［4］。本實驗通過建立高糖環境誘導內皮細胞凋亡，探討丹參酮IIA對內皮的保護作用及其可能機制。

材料和方法

1材料與試劑

M199培養基、青霉素/鏈霉素、胎牛血清購自Invitrogen;胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)、Tan IIA、葡萄糖、甘露醇購自Sigma; Bax、Bcl-2、細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)和β-actin抗體購自CST; Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司; HRP標記II抗、ECL發光劑購自江蘇碧云天生物科技有限公司;其余試劑均為國產分析純。

2人臍靜脈內皮細胞的分離與培養

健康孕婦分娩后臍帶取自九江學院附屬醫院產房。使用適量的胰蛋白酶與37℃消化10 min，收集消化液并置于含有20%胎牛血清、青霉素/鏈霉素的M199培養基，37℃、5% CO2條件下生長匯合。本實驗采用3～5代狀態良好的內皮細胞。

將體外分離培養內皮細胞后隨機分為空白對照組、陰性對照組、高糖處理組、溶劑對照組、藥物組。陰性對照組給予細胞35 mmol/L甘露醇作為等滲透壓對照;高糖處理組直接給予細胞35 mmol/L葡糖糖處理24 h;藥物組為35 mmol/L葡糖糖與10 μmol/L丹參酮IIA共孵育內皮細胞24 h;溶劑對照組則加入與丹參酮IIA相同體積的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。

3實驗方法

3.1MTT法檢測內皮細胞存活率將細胞以5× 106/L密度接種到96孔板，每組5個復孔，經過相應干預后，于實驗結束前4 h避光加入10 μL、5 g/L MTT，混合均勻后于37℃、5% CO2培養箱中孵育4 h，棄去培養基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩15 min溶解結晶體，使用酶標儀于波長為570 nm處測定吸光度(A)表示細胞的存活情況。

3.2內皮細胞凋亡水平的檢測用不含EDTA的胰蛋白酶消化并收集內皮細胞，500 r/min離心10 min，棄上清，收集沉淀。將細胞重懸于緩沖液中，并加入Annexin V-FITC室溫避光反應15 min，隨后立即加入標記緩沖液，并用流式細胞儀觀察細胞凋亡的情況。

3.3線粒體提取人臍靜脈內皮細胞中線粒體提取使用Thermo提供的Mitochondria Isolation Kit，并根據該產品說明書進行操作。

3.4免疫印跡法檢測凋亡信號通路相關蛋白內皮細胞經過相應處理后，使用細胞裂解液收集并離心提取上清蛋白或者使用試劑盒提取線粒體。以考馬斯亮藍法對總蛋白或者線粒體蛋白進行蛋白質定量，隨后于100℃水浴中變性5 min，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，卸下分離膠覆上硝酸纖維膜進行電轉，封閉液封閉后，孵育相應抗體過夜，繼而室溫孵育對應的HRP標記II抗1 h，用ECL試劑盒顯影并用X片感光沖洗，膠片用凝膠成像系統掃描灰度值分析。

4統計學處理

結果采用SPSS 13.0軟件分析，數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，采用單因素方差分析(oneway ANOVA)比較組間差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1丹參酮IIA對高糖抑制內皮細胞存活率的影響

用MMT法檢測內皮細胞的存活率，結果表明與空白對照組相比，陰性對照組對細胞存活率并沒有明顯影響，而高糖處理組中細胞的存活率明顯降低(P＜0.05) ;與高糖處理組相比，藥物組中細胞存活率明顯增加(P＜0.05)，表明丹參酮IIA可抑制高糖引起內皮細胞存活率的減少;溶劑對照組對細胞存活率并沒有干擾作用，見圖1。

Figure 1.The effects of Tan IIA on the cell viability of high glucose-induced HUVECs.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖1丹參酮IIA對高糖刺激的內皮細胞存活率的影響

2丹參酮IIA對高糖誘導內皮細胞凋亡的影響

應用流式細胞術分析內皮細胞凋亡率，結果顯示高糖處理可明顯促進內皮細胞凋亡，與空白對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，而甘露醇處理對細胞凋亡率并沒有明顯影響;與高糖對照組相比，孵育了丹參酮IIA后，內皮細胞的凋亡率明顯減少，見圖2。

3丹參酮IIA對Bax和Bcl-2表達的影響

抗凋亡分子Bcl-2和促凋亡分子Bax以及它們兩者的比率Bcl-2/Bax決定了細胞的生存或者凋亡的狀態。免疫印跡結果表明，與空白對照組相比，高糖處理內皮細胞24 h后，Bax蛋白表達顯著增加(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著減少(P＜0.05) ;而給予丹參酮IIA處理后，高糖所引起Bax蛋白表達的增加和Bcl-2蛋白表達的減少均受到明顯的抑制(P＜0.05) ;空白對照組和陰性對照組之間、溶劑對照組和藥物組之間差異均不顯著，見表3。

4丹參酮IIA對高糖誘導內皮細胞線粒體Cyt C釋放的影響

免疫印跡法結果顯示:高糖處理組線粒體中Cyt C的含量較空白對照組明顯降低，而胞漿中Cyt C的含量明顯升高(P＜0.05) ;藥物可明顯抑制線粒體中Cyt C的減少以及胞漿中Cyt C的增加。提示丹參酮IIA能夠抑制高糖誘導Cyt C從線粒體釋放進入胞漿的過程，見圖3。

Figure 2.The effects of TanⅡA on the apoptosis of high glucose-induced HUVECs.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖2丹參酮IIA對高糖誘導內皮細胞凋亡率的影響

Figure 3.The effects of Tan IIA on the expression of Bax and Bcl-2 in the HUVECs with or without high-glucose treatment.Mean± SEM.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖3丹參酮IIA對Bax和Bcl-2表達的影響

Figure 4.The effects of Tan IIA on high glucose-induced Cyt C release in the HUVECs with or without high-glucose treatment.Mean ±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖4丹參酮IIA對高糖誘導線粒體Cyt C釋放的影響

討論

糖尿病患者心血管疾病死亡率占糖尿病總死亡率的75%以上［5］。內皮功能不全是糖尿病心血管病變的主要特征之一，而血管內皮細胞凋亡則是內皮功能不全的始動環節［5］。內皮細胞凋亡增加不僅造成了血管內皮結構層的損害，還嚴重地損害了血管的正常功能，如抑制血管的舒張功能，促進炎癥反應，削弱血管張力等，最終導致血管病變的發生［6］。因此，如何有效對抗內皮細胞凋亡增加，維持血管內皮層穩態對防治糖尿病心血管并發癥具有重要的意義。中草藥丹參具有活血祛瘀、通經止痛和寧心安神的功效［8］，臨床上廣泛用于多種缺血性疾病的治療。其中丹參酮IIA是丹參脂溶性的有效成分，具有抑制血小板聚集、清除氧自由基、抑制炎癥反應，抗腫瘤活性以及改善微循環等作用［2］。例如，Li等［4］研究發現丹參酮IIA在糖尿病大鼠中可改善高糖所引起的內皮舒張功能障礙，可能與其上調eNOS的表達相關。此外，丹參酮IIA能抑制過氧化氫誘導的人臍靜脈內皮細胞NF-κB的活性［9］。以上研究表明丹參酮IIA在維持內皮功能穩態中發揮著十分重要的作用，然而丹參酮IIA對高糖誘導內皮細胞凋亡的作用及相關機制目前尚不十分清楚。本研究中，我們發現高糖處理后內皮細胞的存活率顯著降低，而丹參酮IIA可逆轉此作用，提示丹參酮IIA可抑制高糖處理后內皮細胞的凋亡率。再者，通過流式細胞術也證實了丹參酮IIA顯著降低高糖導致的內皮細胞凋亡。此外，本實驗還應用免疫印跡法檢測丹參酮IIA作用于高糖處理的內皮細胞后以線粒體途徑凋亡的相關蛋白的表達。其中抗凋亡分子Bcl-2和促凋亡分子Bax決定了細胞生存或者凋亡的狀態，是細胞凋亡內源性線粒體通路的重要調節因子［10］。實驗結果表明丹參酮IIA的處理使Bcl-2的表達增加同時Bax的表達減少，從而增加Bcl-2/Bax比值，使得線粒體膜電位升高，抑制Cyt C從線粒體釋放進入胞漿中。

綜上所述，本實驗證明丹參酮IIA能夠對抗高糖誘導內皮細胞凋亡，其作用機制可能與抑制線粒體Cyt C釋放有關。該研究為治療糖尿病內皮功能紊亂提供了新的實驗依據及思路。

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(責任編輯:林白霜，羅森)

·實驗技術·

Tanshinone IIA prevents high glucose-induced human umbilical vein endothelial cell apoptosis

YU Jian-xin，WU Qi，YANG Huan
(Department of Endocrinology，Affiliated Hospital of Jiujiang University，Jiujiang 332000，China.E-mail: yjx904322@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of tanshinone IIA on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) after high glucose treatment.METHODS: The cell viability was determined by MTT assay.The cell apoptotic rate was examined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining.The expression of Bcl-2 and Bax，and the release of mitochondrial cytochrome C (Cyt C) were analyzed by Western blotting.RESULTS: Tanshinone IIA significantly inhibited high glucose-induced decrease in cell viability and increased the cell apoptosis.Additionally，after tanshinone IIA treatment，Bax expression and the release of mitochondrial Cyt C were significantly inhibited，while Bcl-2 expression was increased.CONCLUSION: Tanshinone IIA prevents high glucose-induced endothelial cell apoptosis via mitochondria-dependent pathway.

［KEY WORDS］Tanshinone IIA; High glucose; Endothelial cells; Apoptosis

通訊作者△Tel: 022-84683114; E-mail: yjx904322@163.com

［收稿日期］2015-04-28［修回日期］2015-05-26

［文章編號］1000-4718(2015)09-1720-04

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.034