赫賽汀誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其對(duì)化療的敏感性*

沈　媛，陸　琳，王曉玉(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州5063;南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州5055)

赫賽汀誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其對(duì)化療的敏感性*

沈媛1▲，陸琳2▲，王曉玉1△
(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州510632;2南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州510515)

［摘要］目的:研究赫賽汀單獨(dú)或聯(lián)合阿霉素(adriamycin，ADR)、順鉑(cisplatin，DDP)及紫杉醇(paclitaxel，PTX)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡和化療敏感性的影響，為臨床應(yīng)用赫賽汀治療子宮內(nèi)膜癌提供理論依據(jù)。方法: MTT法檢測赫賽汀、ADR、DDP及PTX處理子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的IC(50)。進(jìn)一步應(yīng)用1/2 IC(50)量的赫賽汀與各1/2 IC(50)量的ADR、DDP及PTX藥物聯(lián)合，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與凋亡變化。結(jié)果:赫賽汀抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞生長，引起細(xì)胞G1期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞應(yīng)用赫賽汀、ADR、DDP及PTX 的IC(50)分別為57.12 mg/L、0.572 μmol/L、67.4 μmol/L和719.5 nmol/L，赫賽汀聯(lián)合化療后顯著提高各組化療藥的殺傷效果，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與單純化療組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:赫賽汀誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，并提高子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株對(duì)化療的敏感性。

［關(guān)鍵詞］赫賽汀;子宮內(nèi)膜癌;化療敏感性;細(xì)胞凋亡

▲并列第1作者

近年來子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈明顯上升和年輕化趨勢，早期患者預(yù)后良好，晚期以及復(fù)發(fā)性耐藥性患者預(yù)后差，術(shù)后需行進(jìn)一步的輔助治療。對(duì)晚期和復(fù)發(fā)性耐藥性子宮內(nèi)膜癌患者，術(shù)后輔助化療可明顯提高患者的5年生存率。有關(guān)化療方案的選擇，聯(lián)合用藥與單藥化療相比，可明顯提高化療有效率。但目前晚期和復(fù)發(fā)耐藥性子宮內(nèi)膜癌的化療缺乏有效的藥物。赫賽汀是一種人源化單克隆抗體，目前已成為治療腫瘤的重要分子靶向藥物，其抗腫瘤作用是通過與腫瘤細(xì)胞膜上人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)癌基因高表達(dá)產(chǎn)物P185蛋白的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的［1］。HER-2是一種原癌基因，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、分化及存活起著重要的作用，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、治療等密切相關(guān)。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道HER-2基因在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，這些研究結(jié)果明確顯示子宮內(nèi)膜癌有HER-2基因過表達(dá)［2-3］。目前已有不少研究探討赫賽汀抗瘤譜，但在子宮內(nèi)膜癌治療上卻鮮有報(bào)道。腫瘤的藥物研究發(fā)展方向是尋找特異性更強(qiáng)、療效更顯著、毒副作用更低的藥物，本文旨在探討赫賽汀對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期和凋亡變化，及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)化療敏感性的影響，為其在子宮內(nèi)膜癌臨床應(yīng)用中提供理論依據(jù)。

材料和方法

1主要試劑和細(xì)胞株

磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和胎牛血清(杭州四季青公司) ; RPMI-1640培養(yǎng)基和雙氫二氯熒光黃(Gibco) ; MTT(威佳公司) ; TRIzol (Invitrogen) ; Annexin V試劑盒(上海申能博彩公司)。人高分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa由中山醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院李小毛教授惠贈(zèng)，常規(guī)凍存，為超二倍體細(xì)胞，雌激素受體(estrogen receptor，ER)α、ERβ及孕激素受體(progesterone receptor，PR)表達(dá)均陽性。Ishikawa細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

2方法

2.1PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測Ishikawa細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長期Ishikawa細(xì)胞以2.0×108/L濃度接種于96孔板，赫賽汀設(shè)定20、40、60、80 nmol/L濃度。在培養(yǎng)24 h后離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，加入預(yù)冷70%乙醇，于4℃固定過夜。離心收集細(xì)胞，以1 mL的PBS洗細(xì)胞1次，加入500 μL PBS含50 μg/L溴化乙錠(PI)，100 mg/L RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

2.2MTT法檢測赫賽汀聯(lián)合化療藥物處理Ishikawa細(xì)胞的活力取對(duì)數(shù)生長期Ishikawa細(xì)胞以2.0× 108/L濃度接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分5組，無藥物處理的對(duì)照組和赫賽汀、ADR、DDP及PTX 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組化療藥物設(shè)定5個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。赫賽汀設(shè)定20、40、60、80及100 nmol/L濃度，ADR設(shè)定0.1 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、0.75 μmol/L及1 μmol/L濃度，DDP設(shè)定10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L濃度，PTX設(shè)定10、100、500、750和1 000 nmol/L濃度，在培養(yǎng)24、48、72 h后加入四氮唑藍(lán)，4 h后離心棄上清，加入150 μL的DMSO溶解，492 nm濾光片檢測吸光度(A)，細(xì)胞抑制率(%)=(對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A)/(對(duì)照組A-空白組A)×100%，篩選出各藥物的IC50值。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將1/2 IC50赫賽汀和1/2 IC50的ADR、DDP及PTX藥物聯(lián)合應(yīng)用。于培養(yǎng)24、48、72 h后，按上述方法檢測細(xì)胞抑制率。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測赫賽汀聯(lián)合化療藥物誘導(dǎo)Ishikawa細(xì)胞凋亡率和胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平應(yīng)用1/2的IC50量赫賽汀與各1/2的IC50量的ADR、DDP及PTX藥聯(lián)合處理細(xì)胞，培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞PBS洗滌2次后，標(biāo)本等分為2份，其一，PE標(biāo)記Annexin V檢測細(xì)胞凋亡率;其二，雙氫二氯熒光黃染色測定細(xì)胞內(nèi)ROS。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料的描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以析因設(shè)計(jì)資料方差分析比較各組化療藥物間瘤細(xì)胞殺傷的差異，兩獨(dú)立樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，化療藥物與化療藥聯(lián)合赫賽汀間比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1赫賽汀對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期的影響

不同濃度赫賽汀抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa增殖，引起細(xì)胞G1期阻滯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1　赫賽汀誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯Table 1.Effect of Herceptin on cell cycle in Ishikawa cells (%.Mean±SD.n=6)

2赫賽汀聯(lián)合化療對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活力的影響

MTT結(jié)果顯示，赫賽汀、ADR、DDP及PTX作用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的IC50分別為57.12 mg/L、0.572 μmol/L、67.4 μmol/L和719.5 nmol/L。赫賽汀(28.56 mg/L)聯(lián)合ADR(0.29 μmol/L)、DDP (34 μmol/L)及PTX (360 nmol/L)應(yīng)用后，細(xì)胞生長抑制率明顯高于單藥應(yīng)用，見表2。

表2　赫賽汀單藥及聯(lián)合化療對(duì)Ishikawa細(xì)胞生長的影響Table 2.The effects of Herceptin in combination with chemotherapeutic drug on the growth of Ishikawa cells (Mean±SD.n=6)

3赫賽汀聯(lián)合化療用藥24 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)ROS生成

流式檢測赫賽汀單用或聯(lián)合化療24 h后，聯(lián)合用藥組Ishikawa細(xì)胞凋亡及ROS水平明顯增加，見表3。

表3　流式細(xì)胞儀檢測各組凋亡率和胞內(nèi)ROS水平Table 3.The apoptosis rate and ROS levels in Ishikawa cells(%.Mean±SD.n=6)

討論

子宮內(nèi)膜癌是嚴(yán)重威脅我國女性健康的生殖道惡性腫瘤之一。對(duì)晚期及復(fù)發(fā)性患者，中位生存期不足1年，其治療后復(fù)發(fā)率為15%～20%［4-5］。子宮內(nèi)膜癌的化療始于20世紀(jì)60年代，隨著新藥的不斷出現(xiàn)和多中心臨床藥物研究，化療在子宮內(nèi)膜癌的治療中具有越來越重要的價(jià)值，尤其對(duì)于晚期和復(fù)發(fā)性耐藥性子宮內(nèi)膜癌，復(fù)發(fā)耐藥性患者的綜合治療和分子靶向化療在子宮內(nèi)膜癌治療中的研究日益重要。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，隨著腫瘤生物學(xué)研究的深入，人們逐漸了解到惡性腫瘤的形成是一個(gè)多步驟、多因素過程，涉及到多個(gè)癌基因的活化和抑癌基因功能的紊亂，不僅與細(xì)胞增殖和分化異常有關(guān)，同時(shí)也和細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)。凋亡異常參與了子宮內(nèi)膜惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及化療耐藥等諸多環(huán)節(jié)［6-7］。在眾多與子宮內(nèi)膜癌密切相關(guān)的基因中，HER-2基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切的關(guān)系。人HER-2基因于20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)，HER-2癌基因是一種促癌基因，又稱為C-erbB-2或neu或HER-2/neu密碼，位于第17號(hào)染色體q21帶上，編碼一分子量為185～190 kD細(xì)胞膜上的磷脂蛋白，是腫瘤細(xì)胞常發(fā)生異常改變的一個(gè)基因。其具有酪氨酸激酶活性，結(jié)構(gòu)非常類似于表皮生長因子受體EGFR，二者氨基酸序列有50%的同源性［1-3］。HER-2增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移;增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力，破壞機(jī)體組織抗侵襲屏障等，其過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對(duì)普通化療不敏感，但可以和特異性的HER-2單克隆抗體Herceptin結(jié)合，加速HER-2蛋白的降解，從而抑制HER-2對(duì)腫瘤細(xì)胞向惡性表型的轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前研究已證實(shí)，HER-2基因在子宮內(nèi)膜癌表達(dá)高于非癌子宮內(nèi)膜，與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展及生物學(xué)行為相關(guān)［8-10］。

2002年美國FDA批準(zhǔn)了一種全新的藥物赫賽汀是一種人源化的針對(duì)HER-2受體的單克隆抗體。赫賽汀是第1個(gè)用于治療腫瘤的分子靶向藥物，其作用靶點(diǎn)為腫瘤細(xì)胞膜上HER-2基因過表達(dá)的產(chǎn)物。赫賽汀治療療效與腫瘤組織的HER-2基因表達(dá)狀況密切相關(guān)，即HER-2基因表達(dá)強(qiáng)度越高，效果越好。國內(nèi)外研究報(bào)道，HER-2在子宮內(nèi)膜癌組織中的過度表達(dá)不僅與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)，還與化療耐藥、對(duì)激素治療不敏感和預(yù)后也密切相關(guān)［11-12］。赫賽汀開創(chuàng)了腫瘤靶向性治療的新時(shí)代，赫賽汀作為腫瘤靶向性治療應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌的治療上卻少有研究。本研究應(yīng)用赫賽汀處理子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，不同藥物濃度赫賽汀抑制細(xì)胞生長，引起細(xì)胞G1期阻滯，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明赫賽汀對(duì)化療有增敏作用，當(dāng)赫賽汀聯(lián)合ADR、DDP及PTX化療藥物作用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞后，癌細(xì)胞的凋亡顯著提高。應(yīng)用1/2 IC50的赫賽汀和化療藥物均未達(dá)到28%的生長抑制率，1/2 IC50的赫賽汀聯(lián)合1/2的IC50化療藥物處理細(xì)胞顯示，瘤細(xì)胞生長抑制率均達(dá)到40%以上，證實(shí)赫賽汀有化療的增敏作用。腫瘤細(xì)胞耐藥性與抗凋亡蛋白表達(dá)升高有關(guān)，使DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，對(duì)于各種化療藥物的細(xì)胞毒作用產(chǎn)生抵抗，也是化療抵抗的機(jī)制之一，赫賽汀除抑制HER-2之外還阻斷細(xì)胞毒藥物誘導(dǎo)的凋亡，增強(qiáng)化療敏感性。

通過本實(shí)驗(yàn)，我們用赫賽汀體外處理子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)赫賽汀不但可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以提高化療藥物的敏感性，為子宮內(nèi)膜癌提供新的治療方法。

［參考文獻(xiàn)］

［1］李小平，王建六.化療在晚期和復(fù)發(fā)性耐藥性子宮內(nèi)膜癌治療中的作用［J］.中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2015，31(3) : 216-220.

［2］Growdon WB，Groeneweg J，Byron V，et al.HER2 overexpressing high grade endometrial cancer expresses high levels of p95HER2 variant［J］.Gynecol Oncol，2015，137(1) : 160-166.

［3］郎博娟，馬金陽，胡余昌，等.子宮內(nèi)膜癌組織her-2/neu過表達(dá)臨床及病理意義的Meta分析［J］.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2015，28(1) : 49-52.

［4］Groeneweg JW，Hernandez SF，Byron VF，et al.Dual HER2 targeting impedes growth of HER2 gene-amplified uterine serous carcinoma xenografts［J］.Clin Cancer Res，2014，20(24) : 6517-6528.

［5］Teplinsky E，Muggia F.Targeting HER2 in ovarian and uterine cancers: challenges and future directions［J］.Gynecol Oncol，2014，135(2) : 364-370.

［6］Obeidat BR，Matalka II，Mohtaseb AA，et al.Selected immunohistochemical markers in curettage specimens and their correlation with final pathologic findings in endometrial cancer patients［J］.Pathol Oncol Res，2013，19 (2) : 229-235.

［7］Steffen AC，Orlova A，Wikman M，et al.Affibody-mediated tumour targeting of HER-2 expressing xenografts in mice［J］.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2006，33(6) : 631-638.

［8］Chaudhry P，Asselin E.Resistance to chemotherapy and hormone therapy in endometrial cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2009，16(2) : 363-380.

［9］劉淼，魏敏杰，趙福杰.HER-2/neu基因沉默對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa細(xì)胞增殖及其對(duì)孕激素敏感性的影響［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25(S1) : 64.

［10］Odicino FE，Bignotti E，Rossi E，et al.HER-2/neu overexpression and amplification in uterine serous papillary carcinoma: comparative analysis of immunohistochemistry，real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，and fluorescence in situ hybridization［J］.Int J Gynecol Cancer，2008，18(1) : 14-21.

［11］Santin AD，Bellone S，Roman JJ，et al.Trastuzumab treatment in patients with advanced or recurrent endometrial carcinoma overexpressing HER2/neu［J］.Int J Gynaecol Obstet，2008，102(2) : 128-131.

［12］Jewell E，Secord AA，Brotherton T，et al.Use of trastuzumab in the treatment of metastatic endometrial cancer ［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16(3) : 1370-1373.

(責(zé)任編輯:林白霜，羅森)

Mechanism of Herceptin enhancing apoptosis and improving sensitivity to chemotherapy in Ishikawa cells

SHEN Yuan1，LU Lin2，WANG Xiao-yu1
(1Department of Obstetrics and Gynecology，The First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510632，China;2Obstetrics＆Gynecology Department，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China.E-mail: twxy@jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the role of Herceptin in the apoptosis and drug sensitivity of endometrial cancer Ishikawa cells.METHODS: The IC(50)values of Herceptin，adriamycin (ADR)，cisplatin (DDP) and paclitaxel (PTX) for Ishikawa cells were detected by MTT method.Ishikawa cells were treated with single drug and combined chemotherapy for 24 h，the cell cycle and the apoptosis ratio were determined by flow cytometry.RESULTS: The IC(50)values of Herceptin，ADR，DDP and PTX were 57.12 mg/L，0.572 μmol/L，67.4 μmol/L and 719.5 nmol/L，respectively.Herceptin significantly enhanced the cytotoxicity of the chemotherapeutic drugs，and increased apoptosis ratio statistically.CONCLUSION: Herceptin enhances the apoptosis-inducing ability of the chemotherapeutic drugs and improves the chemotherapeutic sensitivity in Ishikawa cells.

［KEY WORDS］Herceptin; Endometrial cancer; Chemotherapeutic sensitivity; Apoptosis

通訊作者△Tel: 020-38688646; E-mail: twxy@jnu.edu.cn

*［基金項(xiàng)目］廣東省科技計(jì)劃(No.2013B021800163) ;暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研培育專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(No.2014102)

［收稿日期］2015-05-21［修回日期］2015-07-10

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1568-04

［中圖分類號(hào)］R730.23

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.006