液態活檢技術的發展及腫瘤領域的應用

陳穎 朱明華

·述評·

液態活檢技術的發展及腫瘤領域的應用

陳穎 朱明華★

廣義而言，液態活檢是指以血液為主的體液標本中細胞及核酸的檢測，包括了循環腫瘤細胞和游離DNA兩大類。液態活檢屬于新型的無創性分子病理檢測方式，具有廣闊的臨床應用前景；對于傳統病理學而言，液態活檢的出現既是機遇也是挑戰。本文主要從分子檢測技術以及臨床應用價值這兩方面綜合闡述了液態活檢作為一種新的非侵入式的檢測方法在臨床腫瘤早期診斷、篩查等領域的發展前景及面臨的挑戰。

液態活檢；非侵入式檢測；分子檢測

組織病理學是在顯微鏡下直接觀察病變組織的形態學改變，因而病理診斷被譽為是疾病診斷的“金標準”，在臨床診斷中具有不可動搖的地位［1］。隨著分子生物學研究日益發展，人類對疾病的認識也不再局限于表型和形態學，根據腫瘤發生的分子機制，形成了分子病理學。分子病理學的研究對象十分廣泛，包含了組織、細胞和體液，而“液態活檢”（liquid biopsy）就是其中的重要分支之一。

“液態活檢”這一概念最早在1974年由Sorrells等［2］提出，當時指關節腔的滑液分析用于診斷滑膜疾病。液態活檢的標本來源主要為以血液為主的體液，其中包括胸水、腹水等其他體液成分，而血液是最容易獲得的臨床標本。本文詳細總結了液態活檢的對象、方法和應用領域，旨在為腫瘤的診斷和治療提供新的手段，為病人的預后和轉歸提供新的依據。

1 液態活檢的研究對象

液態活檢的研究對象主要包括外周血循環中存在的循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）和游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）兩大類。

1.1 循環腫瘤細胞

CTCs的概念雛形最早于1869年由Ashworth提出［3］。當時Ashworth設想，血液循環中可能存在與原發病灶性質相同的腫瘤細胞，而這正是患者體內腫瘤的播散機制。越來越多的研究證實腫瘤患者的外周循環中存在以小簇、團狀形式存在的腫瘤細胞，現在認為CTCs是惡性腫瘤出現血路轉移的主要生物學基礎，其數量的多少與患者的預后關系密切［4］。早期關于CTCs的研究主要集中于乳腺癌，30％～40％左右的乳腺癌患者的外周血或骨髓中可以檢測到CTCs，尤其在缺乏明確淋巴結及遠處器官轉移、臨床分期早期患者的體內就存在，是預測患者未來發生轉移的獨立預后因素［5］。隨著腫瘤特異性標記物應用的廣泛開展和檢測敏感性的提高，在許多惡性腫瘤如肺癌［6］、胰腺癌［7］、前列腺癌［8］、膀胱癌［9］、大腸癌［10］等中均能發現CTCs，而且檢出率也要遠遠高于上述的比例，甚至還有學者將CTCs形容為實體瘤的“白血病樣”階段（leukem ic phase）［11］。腫瘤進展過程中，腫瘤細胞通過基因突變或表觀遺傳學改變等而獲得了更具侵襲能力的生物表型或干細胞特性，其中上皮－間葉轉化（epithelial tomesenchymal transition，EMT）被認為是CTCs出現的主要機制之一［12］。由此看來，CTCs與其起源的原發病灶中的腫瘤細胞雖然相似，但是兩者之間并不存在完全相同基因譜或表達譜系。大量的臨床試驗均證實，CTCs具有很強的預后判斷和轉移預測價值［13］，因此通過研究CTCs的生物學和遺傳學特性相較于原發灶具有更豐富的臨床指導意義。

1.2 循環腫瘤DNA

1948年Mandel和Metais［14］在人類血循環中發現了游離DNA的存在，稱之為“Cell-free DNA”（cfDNA）。此后，cfDNA的檢測開始增多，尤其是作為無創性檢測手段（non-invasive prenatal testing，NIPT）應用于高危孕婦的產前診斷，比如唐氏綜合癥［15］、先兆子癇［16］等。

目前發現腫瘤患者的外周血中也能檢測到游離核酸（cell-free nuclear acids，cfNAs）的存在［17］，認為是由腫瘤細胞產生的，其中以基因組和線粒體DNA成分為主，也被稱為循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），其他還包括RNA和m icroRNA。腫瘤細胞可以是來自組織中的病灶，也可以來自外周血或骨髓中存在的微轉移癌栓或CTCs［18］。腫瘤細胞產生ctDNA主要通過被動和主動機制2種途徑來完成。被動機制是指凋亡和壞死的細胞會釋放出細胞核和線粒體DNA進入血液循環［19］。在正常生理情況下，釋放的DNA數量不多，單核巨噬細胞能及時清除壞死和凋亡細胞的碎片，因此正常人群外周血中的游離DNA含量幾乎測不出來。而腫瘤患者體內由于腫瘤細胞生長快速，壞死和凋亡的細胞數目明顯增加，釋放的DNA數量也多，再加上腫瘤免疫功能的紊亂，不能及時清除，因而造成較多的ctDNA進入外周血循環［20］。主動機制則是指腫瘤細胞能主動釋放DNA到外周循環之中。研究發現，在前列腺癌［18］、肺癌［21］、乳腺癌［22］、大腸癌［23］、肝癌［24］、膀胱癌［25］、宮頸癌［26］、胰腺癌［27］、卵巢癌［28］等人類惡性腫瘤中均能檢測到ctDNA。外周血中提取得到的ctDNA包含了編碼和非編碼DNA，可以用于腫瘤相關基因的遺傳學和表觀遺傳學研究，如基因突變、異常擴增、雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）、微衛星不穩定性（m icrosatellite instability，MSI）、特異性靶點標記、表達譜分析、m iRNA研究、染色體分析以及甲基化等，用于指導臨床用藥、判斷預后、化療效果評估、耐藥性檢測、監測病程進展以及復發轉移的預測等方面。

2 常用檢測技術

2.1 CTCs分離、富集相關技術

2.1.1 免疫磁珠富集法（immunomagnetic beads separation，IMS）

IMS技術基于細胞表面的抗原與連有特異性抗體的磁珠相結合，并在外源磁場的作用下富集細胞，其根據分離的策略可以分為陽性富集法和陰性富集法兩大類。陽性富集法是指磁珠結合得到的細胞就是所需要的細胞。目前唯一已獲得美國食品藥品監督局（Food and Drug Adm inistration，FDA）批準上市的CELLSEARCH?循環腫瘤細胞檢測試劑盒就是針對細胞表面的上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesionmolecule，EpCAM）來分離CTCs。該試劑盒提出了具有臨床預后判斷意義的CTCs的檢出數目：轉移性乳腺癌和前列腺中，CTCs數目小于5個／7.5m L外周血表明患者預后較好；轉移性大腸癌中，CTCs數目小于3個／7.5

m L外周血表明患者預后較好。根據CTCs的含量與臨床預后的關聯其他還在研究階段的磁珠包被標記物如廣譜標記物（全角蛋白）和其他腫瘤類型相關標記物如CerBb2、Mucin、AFP等。此外，用于分離CTCs的標記物除了蛋白質類標記物，還包括了mRNA和端粒酶類的標記物［29］，提高了CTCs的檢出效率。但是腫瘤相關的標記物的種類非常繁雜，并沒有一個標記物能“放之四海而皆準”。基于這些情況產生了陰性富集法。所謂陰性富集法是指磁珠結合得到的細胞不是所需要的細胞，主要應用了針對白細胞的廣譜標記物CD45，在磁場作用中剔除了有核細胞游中的白細胞，其中未被結合的細胞就是所需要的CTCs［30］，能大大增加CTCs的檢出數量。但是免疫磁珠法仍然受到標記物的限制，由于腫瘤細胞與正常細胞存在交叉抗原表達，并且腫瘤細胞本身存在顯著異質性，同一個患者得到的CTCs并不會表達一致性的標記，因此容易出現假陽性或假陰性的結果。

2.1.2 CTCs芯片技術

2007年，麻省總醫院開發了第一代CTCs芯片，能從外周血中分離得到CTCs［31］。第一代CTCs芯片是基于微流體學原理，以微陣距的方式將針對CTCs細胞表面標記物——EpCAM的抗體包被在芯片上，當血液樣本通過芯片時，就能通過抗體將其中的CTCs細胞捕獲下來。經過驗證，Nagrath等發現該芯片技術能高效地獲取99％的轉移性乳腺癌、肺癌、胰腺癌以及結腸癌患者外周血中的CTCs，捕獲的細胞數目范圍在5個～1 281個細胞／m L［31］。2010年，Stott等在第一代CTCs芯片的基礎上經過改良，研發了第二代芯片，因為其陣距類似魚骨樣，因此被稱為鯡魚骨芯片（herringbongchip，HB-chip）［32］。與第一代平板型的芯片不同，第二代根據微流體渦流原理設計了彎道型的內槽，增加了細胞與包被抗體時間的接觸時間，顯著提高了CTCs的獲取效率。因為第二代芯片表面設置的是透明的外殼，因此在芯片上還能進行各種原位檢測，如蘇木素-伊紅染色、免疫熒光染色等，透過芯片通過顯微鏡能直觀地觀察CTCs的形態學特征和染色結果。但是由于目前報道較少，CTCs芯片尚需要得到大規模樣本的驗證才能真正投入臨床應用。

2.1.3 密度梯度離心法（density gradient centrigate，DGC）

DGC技術基于CTCs與有核白細胞具有不同的漂浮系數的原理，在等滲溶液中提取CTCs。商品化的等滲溶液有LymhoPrepTM、Ficoll-HyPaqueTM、OncoquickR等產品。StemCell公司開發的Rosette-SepTM人類循環上皮類腫瘤細胞試劑盒在密度梯度離心的基礎上還添加了針對白細胞的抗體四聚體以增加其沉降效率，減少白細胞對CTCs的干擾。這些檢測方法仍然存在靈敏度較低的缺陷，無法捕捉到少量、稀有的CTCs。

2.1.4 濾過膜分離法（filtermembrane filtration，FMF）

FMF技術基于CTCs的細胞體積顯著大于白細胞的原理，采用一定孔徑的濾過膜將CTCs從血液中分離出來，也被稱為膜濾過分離腫瘤細胞技術（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET），每毫升血液中可以提取到至少1個腫瘤細胞［33］。由于ISET法分離CTCs主要基于細胞的體積而不是細胞表面的相關抗原，因此主要適用于異質性明顯的惡性腫瘤如肺癌、胃癌和前列腺癌等，大大降低了由于抗原交叉表達或差異表達而導致的假陽性率［34］。但正因為如此，ISET法只能分離得到體積較大的CTCs，對于那些體積較小的CTCs就容易濾過，從而得到假陰性的結果。研究者［35］研發了一種結合濾過膜和微機電原理的CTCs分離及原位電裂解系統（m icro-electro-mechanical system／MEMS-based in situ cell lysis），其能更高效地分離CTCs并及時抽提細胞基因組DNA。

2.1.5 基于流式細胞儀的CTCs富集法（flow cytometry-based CTCs enrichment，ImageStream?）

該方法主要針對腫瘤細胞表面特異性抗原并應用流式細胞儀的細胞分選技術篩選分離得到表達相應標記物的CTCs，可選用的標記物包括了角蛋白（cytokeratin）、CA19-9、甲胎蛋白、癌胚抗原、表皮生長因子受體等多種腫瘤相關分子。同樣，由于腫瘤細胞與正常細胞之間的交叉抗原表達，這種CTCs的富集方法也受到了標記物的限制，容易出現假陽性的結果，不能完全保證CTCs的純度。

2.2 ctDNA分離及檢測技術

2.2.1 ctDNA分離技術

ctDNA由于片段較小、含量很少，而且容易和

血漿蛋白相結合，因而常規的提取效率都不高。針對血漿中ctDNA的抽提原理主要有四大類：鹽析法、酚-氯仿抽提法、微柱吸附法和磁珠吸附法。目前商品化的試劑盒絕大多數都是基于以上后兩種原理研發的。而傳統的鹽析法和酚-氯仿法由于操作步驟復雜、需要使用有機溶劑、ctDNA的提取效率較低，現在基本上已經不再使用了。通過比較各類試劑盒發現，磁珠法獲得的ctDNA在質量和含量上都要優于微柱吸附法，假陽性率也較低［36］。

2.2.2 ctDNA檢測技術

ctDNA研究的關鍵技術是如何從外周血中分離得到足夠量的、高質量的游離DNA，相對而言該檢測技術比較簡單。ctDNA檢測技術根據檢測目的來選擇相應的技術方法，其中大部分是以PCR技術為基礎，如實時熒光定量PCR、甲基化特異性PCR等，也有基于微珠富集原理的方法［36］。目前，ctDNA檢測技術已經廣泛地應用于K-ras、BRAF、HER-2、p53、EGFR、APC等腫瘤靶向治療、診斷及預后相關標記的檢測。尤其是新一代測序技術飛速發展的今天，基于ctDNA的全基因組測序、全外顯子測序或全轉錄本深度測序方法將逐漸替代原來傳統的基因突變或測序方法，也將探索出越來越多的腫瘤相關片段，如耐藥、惡性生物學行為等方面。

3 臨床應用價值

3.1 臨床療效監測

由于ctDNA和CTCs的分離和檢測屬于無創性檢測手段，從外周血中提取即能實現，因此很適合臨床上用于監測腫瘤患者的疾病發展及對藥物治療的反應性以及耐藥情況，尤其是藥物靶向治療。腫瘤細胞在藥物作用過程中會通過表型和基因改變形成耐藥性克隆而產生繼發性耐藥現象，目前看來，這是影響藥物治療效果的主要原因。研究者對乳腺癌、卵巢癌和肺癌患者在接受常規化療的不同時相的外周血中游離DNA進行了全外顯子測序，從中篩選得到了一系列基因的改變，如PIK3CA、EGFR（耐藥相關突變T790M）、RB1等基因的突變，可以以此作為監測化療療效的良好靶標［37－38］。

3.2 預后判斷及臨床分期

早期診斷、準確分期以及治療監測是臨床腫瘤學中的重要內容。以往的TNM（tumor，nodal metastasis和distantmetastasis）分期主要是基于腫瘤的臨床特征，如腫瘤大小、侵犯周圍組織的情況、淋巴結和遠處器官轉移情況。組織活檢由于對病人造成一定程度的創傷，往往不能反復多次進行。腫瘤的原發灶和轉移灶之間存在遺傳學、表觀遺傳學甚至轉錄組學的差異。利用外周血中的CTCs或ctDNA能更準確、更高效評估腫瘤的進展，尤其是對于那些不宜進行活檢的患者。

2012年美國癌癥聯合委員會（American Joint Comm ittee on Cancer，AJCC）重新修訂了乳腺癌的TNM分期標準，將“缺乏臨床或影像學證據證實的遠處轉移、但在外周循環、骨髓或其他遠處組織內通過分子生物學或顯微鏡觀察確定存在的、小于0.2mm的轉移灶定位cM 0（i＋）期”，確定了CTCs及ctDNA的重要臨床意義。

研究表明，外周血中出現高頻的腫瘤相關基因突變如p53、KRAS和APC等，往往與較高的臨床分期有關，也預示著患者較差的預后［39］。研究者根據檢測結腸癌患者經過化療后血漿ctDNA中相關基因突變情況，篩選了一套用于預后相關的突變基因譜，認為能近乎100％地預測患者的復發情況［36］。2014年，斯坦福大學的研究者提出了一種基于NimbleGen基因序列捕獲技術的ctDNA深度測序檢測方法，稱為癌癥個體化深度測序分析方法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）。該項技術主要根據已知的腫瘤基因突變數據庫中通過生物信息學篩選得到與腫瘤復發相關的基因，將這些基因的突變區域定制了靶向序列捕獲的篩選器，并在此基礎上進行深度測序［40］。研究者認為應用CAPP-Seq技術分析外周血中分離得到的ctDNA，能準確確定患者的基因型，檢測結果與常規活檢標本得到的結果沒有差別，該技術也有望能取代組織學活檢而成為腫瘤基因檢測的金標準。目前，ctDNA或CTCs能否作為腫瘤復發的檢測指標而廣泛應用于臨床還有賴于大樣本、多中心的臨床試驗進一步證實。

3.3 腫瘤個體化治療靶標

實體腫瘤具有明顯的細胞異質性，不同的腫瘤患者之間同樣也具有明顯的異質性，對放化療的反應均不相同，尤其是隨著分子靶向藥物的應用，令這種個體差異性與套餐式的治療策略之間的矛盾日益突出。根據每個腫瘤患者的“個性”制定個體化的治療方案已經成為了腫瘤輔助治療的必然發展方

向。相對于有創性組織活檢，檢測腫瘤患者外周血或體液中的CTCs或ctDNA的途徑就非常簡便，可以做到隨時取樣、隨時監測，也不會造成醫源性播散。研究者開發了基于新一代單分子測序手段的GUARDANT360技術，通過檢測惡性腫瘤患者血液里ctDNA的基因型來判斷臨床預后以及化療效果［41］。

4 小結和展望

相較于傳統的組織活檢或固相活檢，液態活檢的優勢十分明顯。由于樣本來源是體液，尤其是血液，臨床獲得樣本途徑非常簡便，可以做到隨時取樣、隨時監測，也不會造成醫源性播散。但是液態活檢有一定的局限性。其一，對于ctDNA而言，ctDNA由于存在于外周循環中，含量很低，而且容易受到循環中非腫瘤細胞來源的野生型核酸的稀釋干擾，降低了檢測手段的敏感性；對于CTCs，需要找到合理配伍的腫瘤細胞標記物，增加CTCs的檢出效率。其二，進行ctDNA和CTCs分析之前的樣本收集、處理等環節必須標準化，以降低各實驗室之間的差異。其三，應用CTCs和ctDNA用于預測臨床轉移、復發，尤其對于M 0分期、臨床沒有明確轉移的患者，設定其外周血中CTCs和ctDNA的含量的閾值。

目前液態活檢仍處于研究的初級階段，尚需要大量大規模、多中心的研究進一步證實其臨床應用價值。以形態病理學為基礎，以分子病理學為輔助，兩者相輔相成，液態活檢將為人類更深入地了解疾病的本質提供更豐富的、可靠的手段。

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Recent advances of liquid biopsy and its application in medical oncology

CHEN Ying,ZHU M inghua★
(Department of Pathology,Changhai Hospital,Second M ilitary Medical University,Shanghai,China,200433)

Liquid biopsy refers to the analyses of circulating tumor cells or cell-free fragments of DNA thatmainly exist in the bloodstream and other body fluid.Liquid biopsy is a novel kind of non-invasive technique and has a w ide prospect of clinical application in the molecular pathological field.The occurrence of liquid biopsy is both an opportunity and challenge towards traditional histopathology.In this paper, the advances in the emerging new techniques of liquid biopsy and its clinical application values in the field of cancer care,including prognosis assessment,early cancer screening and prediction of treatment responses w ill be reviewed.

Liquid biopsy；Non-invasive analysis；Molecular test

國家自然科學基金（81172310）

第二軍醫大學附屬長海醫院病理科，上海200433

★通訊作者：朱明華，E-mail：mhzhu2000＠hotmail.com