膽管上皮細胞與缺血再灌注損傷的研究進展

謝 芳，羅渝昆，唐 杰

解放軍總醫院 超聲科，北京 100853

肝移植是目前治療終末期肝病的一種有效方法，在此過程中供肝需經過切取、保存和植入3個步驟，不可避免要經歷缺血再灌注的病理生理過程。缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是一個多細胞參與、多種介質共同作用的復雜病理過程，包括缺血引起的器官損傷以及炎癥介導的再灌注組織損傷，是肝移植術后膽道并發癥的重要因素，嚴重影響著術后肝功能和移植物的存活。現已證實，肝內膽管細胞對缺血再灌注損傷的反應比肝細胞更為敏感，與再灌注密切相關[1]。膽管缺血再灌注損傷主要表現在膽管壁和膽管上皮細胞(biliary epithelial cell，BEC)的損傷以及膽管周圍血管叢微循環障礙，臨床上可引起膽管炎、膽道狹窄，甚至出現膽道缺血性壞死、膽瘺。因此，進一步了解膽管缺血再灌注損傷的機制將有助于其防治策略的研究，減少肝移植術后膽道并發癥的發生。

1 膽管上皮細胞超微結構損傷

膽管上皮細胞是一族高耗氧、高代謝、缺氧耐受能力差的細胞群體，僅占肝細胞總數的3% ～ 5%，形態和功能上都具有多樣性。線粒體是細胞的活性代謝中心，對各種損傷因子極為敏感，是最常見的用于觀察超微結構的細胞器之一。在許多病理性損傷因子(缺血、缺氧)的作用下，線粒體首先受損，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)迅速耗竭，進而損傷整個細胞的功能。因此，超微結構的觀察是研究肝內膽管上皮細胞IRI的一個重要手段。實驗表明，膽管上皮細胞線粒體超微結構的觀察可反映膽道組織IRI的程度[2]。缺血缺氧時，膽管上皮細胞基底膜脫落，同時中性粒細胞浸潤，線粒體腫脹、數量減少，細胞核皺縮，炎細胞浸潤。再灌注后，鈣超載與氧自由基大量生成，二者相互影響、協同作用，導致線粒體結構和功能損傷進一步加重，微絨毛逐漸減少，甚至消失，線粒體膜結構和骨架破壞，通透性增加，能量代謝障礙，直接造成了膽管上皮細胞的損傷。

2 膽管周圍血管叢微循環障礙

膽管的動脈血供相當復雜，隨著肝膽外科的發展，肝動脈的終末分支—膽管周圍毛細血管叢(peribiliary blood plexus，PBP)作為膽管直接的血供來源，在維持其正常生理功能中的作用越來越受到重視[3]。肝細胞接受門靜脈和肝動脈的雙重血供，血管腔較大；而膽管只接受肝動脈分支PBP的血供，管腔較細，因而在IRI時，膽管細胞受到的傷害比肝細胞更加嚴重。黃志強和黃曉強[4]通過觀察兔肝微血管鑄型掃描電鏡也證實了PBP的這種血流灌注特點，這正是肝移植術后肝動脈血流通暢但卻會發生缺血性膽管狹窄的解剖學原因。肝移植過程中，供肝冷凍保存時間過長，可直接損害肝竇內皮細胞及膽管上皮細胞，并破壞PBP的微循環。在原位肝移植手術過程中，膽管還要經歷兩個階段的熱缺血損傷[5]，一是供肝切取過程中的短暫熱缺血損傷，二是門靜脈血流開放至肝動脈血流開放過程中的肝動脈缺血損傷。在此期間，肝尚有門靜脈單純血供，而膽管仍處于熱缺血狀態，因此，膽管缺血再灌注損傷更加明顯。病理實驗證實，門脈區膽管上皮細胞損傷程度與二次熱缺血時間密切相關[6]。

3 膽管上皮細胞的炎癥損傷

現已證實，結構特殊的膽管也是冷、熱缺血及再灌注損傷的重要靶組織。目前認為，缺血再灌注損傷的機制與鈣超載、氧自由基增多及炎性細胞聚集等有關。缺血期，由于組織缺氧導致細胞代謝紊亂，ATP耗竭及微循環障礙，膽管上皮細胞脫落，微絨毛數量減少，甚至出現黏膜全層水腫、壞死、纖維化形成而致狹窄。隨著再灌注時間的延長，中性粒細胞不斷聚集，組織損傷反而加劇，進而引起一系列炎癥反應，并且生成的氧自由基和蛋白酶產生強烈的細胞損傷放大效應[7]。許多炎癥介質參與了膽管IRI這一復雜的病理生理過程，如激活的枯氏細胞、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素(IL)、5-羥色胺、血小板活化因子、內皮素、一氧化氮、花生四烯酸代謝產物、前列腺素、趨化因子和黏附分子等。這些介質通過自分泌、旁分泌或類似激素的方式誘導其自身及其他因子產生，形成一個細胞炎癥反應的分子鏈，使膽管上皮細胞的損傷呈進行性加重。膽管上皮細胞來源的5-羥色胺(5-HT)以及門管區成纖維細胞來源的TGF-β介導了BEC與成纖維細胞之間的自分泌與旁分泌效應，以維持BEC的增殖，在膽管病發病機制中具有重要的意義[8]。此外，由于膽管上皮細胞內缺乏抗氧化酶系，如過氧化氫酶、過氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽，因而較肝細胞更容易受到再灌注時氧自由基的損傷。

肝移植缺血再灌注損傷后，PBP和其內皮細胞也廣泛參與了膽管免疫炎癥反應的病理過程，包括血管通透性增加、內皮細胞炎癥反應、血管收縮、血細胞淤塞以及補體系統的激活，其中細胞間黏附分子-1(ICAM-1)及血小板—白細胞聚合物進一步加劇了PBP的微循環障礙。

4 膽管上皮細胞的免疫學損傷

肝是最重要的具有天然免疫功能的器官，它通過門靜脈接收并過濾其他系統80%的血液。再灌注損傷后，膽管上皮細胞積極參與肝內免疫介導的無菌性炎癥，激活炎癥細胞；并通過自身免疫應答，誘導主要組織相容性抗原分子的上調或表達，完成抗原提呈過程；分泌和表達促炎性細胞因子、化學趨化因子及黏附分子，激活天然和獲得性免疫反應，引發移植物損傷，使膽管成為肝移植后膽道并發癥的靶器官[9]。

目前，在缺血再灌注免疫損傷中研究較多的是Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)，它是參與天然免疫的一類重要蛋白質，也是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。TLR廣泛表達于肝的實質細胞和非實質細胞，包括肝細胞、肝竇內皮細胞、枯氏細胞、淋巴細胞、膽管上皮細胞及星狀細胞，對肝及膽道的功能起著至關重要的作用。新近研究發現，TLR不僅可識別外源性病原體，如疾病相關分子模式，還能夠識別機體自身產生的內源性配體，即損傷相關分子模式(damage associated molecular pattems，DAMPs)，并激活機體產生免疫細胞應答[10]。DAMPs通常隱藏于細胞內，缺血再灌注損傷后，被一些受損或死亡的細胞激活，釋放到細胞外而引起免疫反應。也有證據表明，細胞外的DAMPs是在代謝過程中生成或釋放的，缺血再灌注損傷時，這種在分解代謝中產生的DAMPs既可以激活免疫反應，也可以作為一個安全信號，抑制有害的免疫反應，而保護組織的完整性[11-12]。最近的研究表明，TLR信號轉導對天然免疫及獲得性免疫均有重要的調控作用[13]。TLR介導的信號轉導幾乎參與了所有的肝疾病，如急性和慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝缺血再灌注損傷、肝再生和肝細胞癌。TLR被配體識別后，激活下游的核轉錄因子Kappa B、促分裂原活化蛋白激酶以及Ⅰ型干擾素信號通路，分泌促炎性細胞因子(TNF、IL-6、IL-1β)和化學趨化因子，從而調節機體輔助性T細胞的平衡[9]。

枯氏細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、T細胞及NK/ NKT細胞也都參與了缺血再灌注損傷引起的免疫反應。目前，T細胞在無菌性炎癥環境下被激活的機制仍然沒有深入了解，但證據表明，T細胞激活具有抗原特異性及抗原獨立性[14]。實驗表明，CD4+和CD8+T淋巴細胞參與了腸道組織缺血再灌注損傷的過程[15]，CD2和CD28 T淋巴細胞在鼠肺缺血再灌注損傷中均具有損傷的作用[16]；補體調節蛋白CD59在小鼠腦缺血再灌注24 h后顯著降低，其可能也參與了腦缺血再灌注的免疫損傷過程[17]。

5 膽管缺血再灌注損傷的影像學診斷及防治

目前，臨床上診斷膽管疾病主要依靠各種影像學手段，包括ERCP、PTC、MRCP和超聲，都是通過顯示膽管狹窄、擴張等形態學改變來診斷。而超聲檢查具有無輻射、經濟便捷、實時動態、可用于術中及床旁等顯著優勢，已成為膽道疾病首選的影像學檢查之一[18]。由于膽道系統的特殊性，超聲造影劑不僅可以通過靜脈，還能經膽管腔內注入，從而觀察膽管腔外和腔內的結構。鄭榮琴等應用經靜脈注入超聲造影劑對膽管壁微循環灌注進行實時、無創觀測，通過檢測膽管周圍毛細血管叢的血流灌注狀態對膽道缺血進行評價，其改變可能早于形態學變化[19]。Nunoi等[20]結合超聲造影與彩色多普勒，為門脈性膽道病的診斷及鑒別診斷提供了直觀而特異的形態學檢查方法，避免了病人遭受膽道活檢和外科手術的痛苦。盡管如此，超聲造影對于膽道炎癥、缺血性病變的診斷價值還缺乏更多的相關證據。因此，筆者認為超聲造影對于膽道病變的診斷價值還有待進一步深入研究。

過去10年，對于再灌注損傷的機制研究已經取得了很大進展，而且也提出了很多確實有效的策略來預防缺血或再灌注損傷[21-22]。缺血預適應就是一種重要的臨床治療方法[23]。新近一項研究報道，肝切除術前采取多次間斷缺血、再灌注，較單純缺血預適應可更加有效地減輕肝組織損傷，而且，缺血與再灌注間隔時間越短，肝損傷越小[24]。實驗研究表明，低溫機器灌注與經典的靜態冷藏器官保存方法相比，可更好地保護肝實質，防止膽管周圍血管叢小動脈壞死，有助于更快地恢復缺血性膽管的血流再灌注[22]。除此之外，大量的藥物實驗研究模擬缺血預處理的機制，為缺血再灌注損傷治療提供了新的強有力的依據。例如，應用脯氨酸羥化酶抑制劑或腺苷受體激動劑調控能量代謝過程可以增加組織缺血耐受力[25-26]；在冠狀動脈旁路移植術前應用激活的線粒體醛脫氫酶可增強患者心肌缺血的耐受性[27]。實驗證明，一些治療性的氣體包括氫氣、一氧化氮、硫化氫和一氧化碳也可以減輕再灌注損傷[28]。另外，Sheng等[29],研究報道，植入自體骨髓單核細胞能夠顯著減少肝內膽管上皮細胞的凋亡，從而預防及減少肝內膽道缺血的發生。缺血再灌注損傷的干預及治療措施目前已進入了臨床試驗階段，其安全性和有效性正在論證。一些藥劑已經在小型臨床試驗中取得了非常好的結果，但仍需要大樣本的臨床研究證實。

6 展望

膽道缺血再灌注損傷在肝移植后的發生率仍然很高。只有深入理解缺血再灌注損傷的炎癥免疫學機制，深入闡釋缺血再灌注損傷與膽管疾病之間的關系，利用更完善的外科技術及更有效的預防治療策略，才會減少肝移植術后膽道并發癥的發生。低溫機器灌注已經受到了越來越多的研究和關注，具有潛在的優勢，可以更好地保護脆弱的膽管。目前，大多數研究表明，這種技術(如溫度、時間等)還需要探索與改善。盡管如此，低溫機器灌注仍然具有良好的前景，有可能成為一種新技術，有效地減少膽道缺血再灌注的損傷。盡管未來還有很大的挑戰，我們還是希望有更好的探索及新的療法應用于缺血再灌注損傷的臨床實踐中，推動肝移植的發展。

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