米貝地爾對大鼠側腦室下區神經干細胞體外增殖的影響

張 熙，尉春艷，古 茹，周 樂

西安交通大學第二附屬醫院，陜西西安 710004 1神經外科；2婦產科；3手術麻醉科

神經干細胞治療中樞神經細胞損傷是目前的研究熱點。神經干細胞具備以下幾個優點：1)在不同微環境中可分化為不同功能的細胞，即多分化潛能；2)可在移植區域釋放神經營養因子，優化損傷區域內神經功能恢復的內環境；3)可以免受大多數的繼發性損傷分子的影響。我們的前期研究證明，腦外傷后側腦室下區神經干細胞增殖能力明顯增加[1]，但是在修復過程中仍然面臨著體內增殖、定向分化以及穿越膠質屏障重建突觸連接等一系列困難。研究表明，T型鈣通道與細胞的增殖密切相關[2-3]，抑制T型鈣通道的表達可抑制細胞周期蛋白，如Cyclin A、Cyclin D蛋白等，阻斷細胞周期進程，抑制細胞的增殖。米貝地爾是特異性的T型鈣通道阻滯劑。本實驗通過研究體外條件下T型鈣通道阻滯劑米貝地爾對神經干細胞增殖的影響，間接闡明T型鈣通道在神經干細胞增殖中的作用。

材料和方法

1 主要材料與試劑 成年8周齡SD大鼠6只，清潔級，雄性，體質量200 ～ 250 g，由西安交通大學醫學院動物中心提供。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)(50μg)，重組堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(10μg)購自GIBICO公司，Nestin抗體(0.1 ml)，GFAP抗體(0.1 ml)，NSE抗體(0.1 ml)購自北京博奧森生物技術有限公司，米貝地爾(5 mg)購自Sigma公司。

2 腦損傷動物模型的建立 按文獻[4]的方法，用液壓損傷法建立腦損傷動物模型。用0.12 mol/L的苯巴比妥鈉經腹腔麻醉(30 mg/kg)，無菌條件下，沿頭顱矢狀縫做長約1 cm的正中切口，暴露顱骨外板，在頭顱立體定位儀引導下，在冠狀縫后2.3 mm，矢狀縫旁開1.5 mm的右側頂葉選取坐標點，用顱骨鉆打開顱板，顯示硬腦膜，將打擊管埋置于硬腦膜外，并用牙托水泥固定。24 h后以0.2 MPa的壓力沖擊右側頂葉皮質造成中度側位液壓沖擊腦損傷。

3 神經干細胞的分離培養 將腦損傷術后7 d的成年大鼠，用0.12 mol/L的苯巴比妥鈉經腹腔麻醉(30 mg/kg)，無菌條件下暴露腦并剝離硬腦膜，以室下區為中心，迅速切除長1.0 ～ 1.5 cm腦組織，取出置入冷凍的D-hanks液中，沿側腦室面切取室下區，修去損傷區附近的腦組織后，盡量剪成0 ～ 1 mm3的組織碎屑。將這些室下區碎屑移入含有0.1%的胰蛋白酶、0.67mg/ml的透明質酸酶和0.1 mg/ml DNA酶的混合酶液中，在培養箱(37℃，95% O2和5% CO2)中消化30 min后，移入預先已加有等體積的0.125%的大豆胰酶抑制劑的離心管內，反復吹打，盡可能地將殘余的室下區組織小塊機械性分離開來。銅網過濾。將濾過的液體收集入離心管內，800 r/min離心5 min，棄去上清液。然后再用基礎培養基重懸細胞，800 r/min離心5 min。如此反復重復5 ～ 6次后，用神經干細胞完全培養基重懸細胞，經臺盼藍實驗鑒定細胞活力后，調整細胞密度為50 000 ～ 100 000/ml，種入培養瓶內懸浮培養。接種24 h后換1次培養液，以后每隔7 d半量換液。以上過程均在無菌間內完成。

4 神經干細胞鑒定 單細胞懸液接種在事先用多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，37℃孵箱培養(95% O2和5% CO2)2 h后，行抗Nestin免疫染色。培養得到的神經干細胞克隆球用機械法傳代以鑒定自我增殖能力。將培養獲得的神經干細胞單細胞懸液/神經球接種在包被有多聚賴氨酸的蓋玻片上，用含有10%胎牛血清的神經干細胞培養液進行誘導。24 h后隨機分為兩組：第一組行抗GFAP免疫染色，第二組行抗NSE免疫染色。

5 米貝地爾對神經干細胞球的影響 取第二代細胞，獲取單細胞懸液，37℃孵箱培養(95% O2和5% CO2)培養24 h。培養基中分別加入米貝地爾0 μmol/L、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L，37℃孵箱培養(95% O2和5% CO2)繼續培養，4 d后檢測各組神經干細胞球數。

6 MTT檢測 取第二代細胞，獲取單細胞懸液，以1 000 ～ 10 000/孔接種于96孔板，每孔200μl，37℃孵箱培養(95% O2和5% CO2)培養24 h。將米貝地爾以0 μmol/L、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L的濃度分別加入接種有單細胞懸液的96孔板內，按米貝地爾濃度分6組，每組6孔，液體差異以完全培養基補足。37℃孵箱培養(95% O2和5% CO2)繼續培養48 h。48 h后，每孔加5 mg/ml MTT液20μl，作用4 h后將96孔板置離心機內1 000 ～ 2 000 r/min離心5 min，使細胞球貼壁；小心吸棄培養基，加入DMSO 100μl/孔，室溫下搖床震蕩10 min，使結晶溶解，酶標儀檢測各孔570 nm波長下OD值。并根據OD值計算細胞存活率、增值抑制率、半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD值-空白組OD值)；增殖抑制率=1-(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)。

7 Western blot檢測 將細胞分為實驗組和對照組，實驗組中根據IC50值加入相應濃度的米貝地爾，對照組中加入等量的PBS溶液，提取細胞總蛋白，經10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至聚偏氟乙烯膜。封閉2 h后與兔抗鼠Cyclin A抗體孵育過夜，二抗孵育1 h，化學發光顯色，以β-actin為內參校正。

8 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件處理，計量資料以-x±s表示，組間比較使用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 神經干細胞鑒定 細胞接種3 d后，在培養瓶中可發現有明顯的干細胞克隆球形成，在顯微鏡可見這些干細胞克隆球由數十個細胞緊密聚集而成，克隆球大小不均等，細胞邊緣光滑、中心膨隆有立體感，在形態上和簡單的細胞聚集有顯著差異(圖1)。細胞傳代后培養瓶中仍然可以長出類似的細胞球，且數目明顯增多，細胞碎屑明顯減少(圖2)。免疫熒光標記顯示這些細胞球表達神經干細胞的特征性標記物-Nestin，免疫染色呈強陽性(圖4)。誘導分化后2 h即可見部分細胞自細胞球內向外遷移。2 d后大量細胞自細胞球內遷移出，并開始形成短小的突起，1周后鏡下可見細胞形態成熟，可明確區分出各類神經細胞，視野下大部分為膠質細胞，尤以星形膠質細胞為主，神經元較少，散在分布，細胞突起相互間交織成網狀(圖3)。免疫熒光染色可見一部分細胞表達GFAP蛋白，一部分細胞表達NSE蛋白(圖4)。

2 米貝地爾對神經干細胞球的影響 對照組細胞增殖快，鏡下見大量細胞球，細胞球形態規則，邊緣光滑，中心膨隆有立體感，未見皺縮細胞及細胞碎片。隨著米貝地爾濃度增加，鏡下細胞球數量逐漸減少，直徑也隨之減小，形態尚規則，并可見越來越多的皺縮細胞。至10μmol/L組鏡下僅見數十個細胞組成的小細胞球，且細胞球數目極少，周圍有大量細胞碎片。20μmol/L組鏡下未見正常形態的神經干細胞及神經球，視野中全部為死亡細胞皺縮形成的細胞碎片(圖5)。

圖1 原代培養神經干細胞形態(×40)A： 第3天； B：第6天Fig. 1 Neural stem cell morphology in primary culture (×40)A: The third day; B: The sixth day

圖2 第一次傳代培養神經干細胞形態(×40)A： 第3天； B：第6天Fig. 2 Neural stem cell morphology after the f rst passage (×40)A: The third day; B: The sixth day

圖3 誘導分化神經干細胞后的形態(×40)A： 第1天； B：第7天Fig. 3 Neural stem cell morphology after induction and differentiation (×40)A: The first day; B: The seventh day

圖4 免疫熒光染色神經干細胞的形態(×40) A： Nestin； B： GFAP； C： NSEFig. 4 Immunof uorescence staining of neural stem cell (×40)A: Nestin staining of neural stem cell sphere; B: GFAP staining of neural stem cell after induction and differentiation; C: NSE staining of neural stem cell after induction and differentiation

3 MTT檢測 與對照組相比較，1.25μmol/L組及2.5μmol/L組OD值稍降低，細胞存活率及增殖抑制率差異無統計學意義(P＞0.05)。5μmol/L組、10μmol/L組和20μmol/L組與對照組比較，細胞存活率及增殖抑制率差異均有統計學意義。隨著米貝地爾濃度增加，尤其是≥5μmol/L時，其對神經干細胞的增殖具有明顯的抑制作用(圖6，表1)。計算得IC50為8.93μmol/L。

4 Cyclin A蛋白的表達 在實驗組中加入米貝地爾，Cylclin A蛋白的表達明顯降低(圖7)。

討 論

神經干細胞具有自我更新能力并且能夠分化產生不同類型的神經細胞，利用神經干細胞治療中樞神經系統損傷成為目前的研究熱點。它可通過：1)產生外源性神經元，橋接損傷斷端，形成功能性突觸，重新建立神經傳導通路。2)分化產生少突膠質細胞，使損傷的脫髓鞘軸索再髓鞘化，恢復有髓神經電傳導功能[5]。3)分泌多種神經營養因子改善脊髓局部微環境，對神經進行保護及免疫抑制作用[6]。4)啟動再生相關基因的順序表達使軸突再生，產生多種細胞外基質，填充脊髓損傷后遺留的空腔，為再生軸突提供支持物等機制達到治療的目的。雖然理論上干細胞移植治療神經系統損傷具有美好前景，但實際操作中仍然面臨著許多問題，比如損傷后膠質瘢痕阻礙軸突再生，損傷局部微環境及繼發損傷不利于移植細胞存活及增殖，神經干細胞定向分化等[7-8]。

表1 不同濃度米貝地爾作用下神經干細胞的存活率及增殖抑制率Tab. 1 Survival rate and proliferation inhibition rate of neural stem cell in each group after adding different concentrations of mibefradil

圖5 加入不同濃度米貝地爾后各組神經干細胞球的鑒定A： Control組 B： 1.25μmol/L組； C： 2.5μmol/L組； D： 5μmol/L組； E： 10μmol/L組； F：20μmol/L組Fig. 5 Identif cation of neural stem cell spheres in each group after adding different concentrations of mibefradilA: Control group; B: 1.25μmol/L group; C: 2.5μmol/L group; D: 5μmol/L group; E: 10μmol/L group; F: 20μmol/L group

圖6 加入不同濃度米貝地爾后各組OD值的鑒定Fig. 6 Identif cation of OD value in each group after adding different concentrations of mibefradil

圖7 兩組中Cyclin A蛋白的表達Fig. 7 Expression of Cyclin A protein in two groups

T型鈣離子通道又名低電壓激活鈣通道，它具有易激活，失活緩慢，需要的電壓閾值較低等特點[9-10]。T型鈣通道家族包括3種T型鈣通道亞型：Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3，廣泛表達于腦組織中，主要位于下橄欖核、丘腦、海馬、下丘腦、室旁核、腦干網狀結構、小腦深部核團、蒼白球以及丘腦底核等[11-12]。Cav3.1蛋白主要位于神經元胞體和樹突近端，Cav3.2蛋白主要位于神經元胞體和樹突近端至中間部分，Cav3.3蛋白主要表達于特定類型細胞的胞體及樹突[13]。研究表明，多種組織損傷后其內部的T型鈣離子通道的表達明顯上調[14]。我們的前期研究證明，顱腦損傷后腦組織內神經干細胞的增殖能力明顯增加[1,15]。但是該過程是否與T型鈣離子通道有關尚無定論。本研究構建了顱腦損傷模型，分離并培養側腦室下區神經干細胞后，應用T型鈣通道阻滯劑米貝地爾可明顯抑制神經干細胞的增殖能力，說明了T型鈣通道在神經干細胞的增殖過程中起著十分重要的作用。因此，在神經損傷后維持T型鈣離子通道的功能，可促進神經干細胞的增殖，有利于神經損傷的修復。

在細胞的生長過程中，細胞只有通過了G1/S和G2/M期后才能夠進行DNA的復制和增殖。在G1/S期，細胞需要外源性鈣離子以及鈣離子通道參與，刺激DNA復制所需的關鍵酶的分泌[14]。研究證明，T型鈣通道存在于細胞的G1/S期，在其他階段表達明顯下調[16-17]。因此，T型鈣通道在G1/S期發揮著十分重要的作用。Cyclin A的合成發生于G1期向S期的轉變過程中，在中期時消失，屬S期周期蛋白[18]。米貝地爾能夠明顯抑制Cyclin A蛋白的表達，說明它可能通過抑制細胞周期進展，尤其抑制是G0/G1期向S期進展，導致細胞凋亡，抑制神經干細胞的增殖，但其具體機制還需進一步研究。

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