刺五加注射液對大鼠腎缺血再灌注損傷的影響

李 強，靳書濱，李 峰，霍韶軍，張瑞剛

(邯鄲市中心醫院泌尿外科，河北 邯鄲 056001)

刺五加注射液對大鼠腎缺血再灌注損傷的影響

李 強，靳書濱，李 峰，霍韶軍，張瑞剛

(邯鄲市中心醫院泌尿外科，河北 邯鄲 056001)

目的 探討刺五加(Aeanthopanax senticosus，AS)注射液預處理對大鼠腎缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)的保護作用及其機制。方法于2013年12月至2014年5月，實驗采用單動脈夾閉法構建大鼠急性腎IRI模型。選用36只健康雄性SD大鼠，按照隨機數字法，隨機分為六組，每組6只：(1)對照5 h組(Control 5 h組)；(2)對照10 h組(Control 10 h組)；(3)缺血再灌注損傷5 h組(IRI 5 h組)；(4)缺血再灌注損傷10 h組(IRI 10 h組)；(5)刺五加注射液預處理后腎缺血再灌注損傷5 h組(AS 5 h)；(6)刺五加注射液預處理后腎缺血再灌注損傷10 h組(AS 10 h)。Control組術中僅切除右腎；IRI組及AS組采用切除大鼠右腎，夾閉左側腎動脈，45min后解除夾閉。AS組于術前5 d每天給予1次及術前0.5 h給予1次刺五加注射液，按100 mg/kg腹腔注射；Control組及IRI組術前5 d及術前0.5 h給予腹腔注射和AS同等劑量的生理鹽水。各組于相應的時間點采集下腔靜脈血及左腎組織，然后處死各組實驗大鼠，檢測各組大鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)，腎組織超氧化物岐化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量，HE染色光鏡下觀察各組大鼠腎臟組織的病理變化。結果AS預處理組腎組織病理變化輕于IRI組；與Control組相比較，IRI組的BUN、Scr水平升高(P＜0.05)，腎組織中的SOD降低及MDA水平增加(P＜0.05)。而AS預處理組的Scr、BUN和腎組織的MDA均比IRI組低(P＜0.05)，而腎組織中的SOD水平升高(P＜0.05)。結論AS對腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能是通過抗氧化作用實現的。

刺五加注射液；腎缺血再灌注損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛

腎缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)在臨床上比較常見。外科常見的是外傷急性失血、術中失血、心臟驟停、腎部分切除術、腎移植、腎動脈重建、腎盂積水、腎擠壓傷等，是目前國內外研究的重要課題。再灌注損傷發生時最重要病理機制是大量氧自由基的產生，產生的大量自由基通過脂質過氧化嚴重損傷細胞。研究證明刺五加(Aeanthopanax senticosus，AS)具有良好的抗氧化、清除氧自由基、增強機體抗氧化功能的作用[1-2]。本研究在建立大鼠腎IRI模型的基礎上研究AS對大鼠腎IRI的防治作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 刺五加注射液：黑龍江烏蘇里江制藥廠生產，每支100ml，含總黃酮300 mg。SOD、MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；722分光光度計產于江蘇無錫柯達智能儀器廠；電熱恒溫隔水式培育箱產于湖北省黃石市醫療器械廠；高速低溫離心機產于Sigma公司；超低溫冰箱產于Forma scientific company。

1.2 動物及分組 本實驗采用單動脈夾閉法構建大鼠急性腎缺血再灌注損傷模型。選用36只健康雄性SD大鼠，按照隨機數字法，隨機分為六組，每組各6只：(1)對照5 h組(Control 5 h組)；(2)對照10 h組(Control 10 h組)；(3)缺血再灌注損傷5 h組(IRI 5 h組)；(4)缺血再灌注損傷10 h組(IRI 10 h組)；(5)AS預處理后腎缺血再灌注損傷5 h組(AS 5 h組)；(6)AS預處理后腎缺血再灌注損傷10 h組(AS 10 h組)。

1.3 方法 Control組術中僅切除右腎；IRI組及AS組采用切除大鼠右腎，夾閉左側腎動脈，45min后解除夾閉。AS組于術前5 d每天給予1次及術前0.5 h給予1次刺AS，按100 mg/kg腹腔注射；Control組及IRI組術前5 d及術前0.5 h給予腹腔注射和AS同等劑量的生理鹽水。各組于相應的時間點采集下腔靜脈血及左腎組織，然后處死各組實驗大鼠，檢測各組大鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)，腎組織超氧化物岐化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；HE染色光鏡下觀察各組大鼠腎臟組織的病理變化，

1.4 觀察指標

1.4.1 腎組織病理檢查 將甲醛固定后的腎臟組織用乙醇階梯脫水后，二甲苯透明，HE染色，連續切片，切片厚度為3～4 μm，光學顯微鏡下觀察，了解腎組織的損傷情況。

1.4.2 實驗室檢查 (1)Scr、BUN標本由邯鄲市中心醫院檢驗科自動生化分析儀檢測。(2)腎組織勻漿SOD活力、MDA含量按說明書方法測定，組織蛋白測定用雙縮脲法。

2 結果

2.1 腎組織病理改變 HE染色光鏡下，Control組可見腎小球、腎小管結構較清楚，形態基本正常，腎小管上皮細胞未見明顯腫脹，無變性、壞死，腎間質改變和炎性細胞浸潤不明顯(見圖1)；IRI組病變主要在腎小管，可見到腎小管上皮細胞空泡變性，細胞脫落，炎性細胞浸潤明顯，部分腎小管可見細胞碎片，腎間質水腫、充血、炎癥細胞浸潤(見圖2)；而AS組主要病理表現為腎小管變性，細胞脫落較IRI組減少，腎間質水腫、充血、炎性浸潤等病理改變較IRI組明顯減輕(見圖3)。

圖1 Control 5 h組和Control 10 h組的大鼠腎組織病理變化(HE染色×200)

圖2 IRI 5 h組和IRI 10 h組的大鼠腎臟組織病理變化(HE染色×200)

圖3 AS 5 h組和AS 10 h組的大鼠腎臟組織病理變化（HE染色×200）

2.2 各組Scr、BUN水平的變化 由表1可以看出，在5 h時IRI與Control組比較Scr、BUN均明顯升高，差異有統計學意義(P=0.000、P=0.001)，10 h比較差異也有統計學意義(P=0.002、P=0.001)。在5 h時AS組與Control組比較，Scr、BUN均明顯升高，差異有統計學意義(P=0.001、P=0.000)；10 h時比較發現Scr、BUN均升高，差異有統計學意義(P=0.000、P= 0.003)。在缺血再灌注5 h時，AS組與IRI組比較，發現Scr、BUN明顯降低，差異有統計學意義(P=0.000、P=0.000)，在10 h時Scr、BUN也明顯降低，差異有統計學意義(P=0.000、P=0.001)。從IRI 5 h組和IRI 10 h組相比較結果來看，IRI 10 h組Scr、BUN明顯升高，差異有統計學意義(Scr：t=-5.439，P=0.001；BUN：t=-6.777 2，P=0.000)。

表1 各組大鼠不同時間點Scr、BUN水平變化(±s)

表1 各組大鼠不同時間點Scr、BUN水平變化(±s)

注：a表示與Control組同時比較，P＜0.05；b表示與IRI組同時比較，P＜0.05；c表示與IRI 5 h組比較，P＜0.05。

組別BUN(mmol/L)例數Scr(μmol/L) Control 5 h組Control 10 h組IRI 5 h組IRI 10 h組AS 5 h組AS 10 h組3.89±0.29 4.26±038 16.89±1.78a21.4±2.5ac7.51±5.53ab11.54±1.28ab6 6 6 6 6 6 48.42±4.2 46.44±3.9 155.31±15.68a224.26±18.75ac103.39±8.60ab106.51±9.8ab

2.3 各組腎組織MDA、SOD水平的變化 由表2可以看出，在5 h和10 h兩個時間點分別比較：IRI組與Control組比較，SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統計學意義(5 h：P=0.002、P=0.003；10 h：P=0.003、P=0.001)。AS組與Control組比較SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統計學意義(5 h：P=0.003、P=0.002；10 h：P=0.003、P= 0.002)。AS組與IRI組比較SOD活性升高，MDA含量則下降，差異有統計學意義(5 h：P=0.001、P=0.002；10 h：P=0.000、P=0.002)。

表2 各組大鼠不同時間點腎組織MDA、SOD水平變化(±s)

表2 各組大鼠不同時間點腎組織MDA、SOD水平變化(±s)

注：a表示與Control組同時比較，P＜0.05；b表示與IRI組同時比較，P＜0.05；c表示與IRI 5 h組比較，P＜0.05。

組別MDA(nmol/mg)例數SOD(U/mg) Control 5 h組Control 10 h組IRI 5 h組IRI 10 h組AS 5 h組AS 10 h組8.08±1.23 7.5±1.45 26.45±3.25a40.32±4.22ac13.16±2.14ab11.38±2.2ab6 6 6 6 6 6 112.7±11.08 125.45±6.35 55.48±6.15a45.61±4.76ac78.24±4.52ab63.78±5.28ab

3 討論

組織細胞的正常功能，需要良好的血液循環。各種損傷使組織血液灌注減少后，可使組織細胞發生缺血性損傷，及時恢復組織血供，是治療缺血性損傷的主要方法。但發現部分患者恢復血液再灌注后，細胞功能及結構破壞反而加重，這種現象稱為缺血-再灌注損傷。其發病機制至今尚未完全闡明，目前研究表明它與大量氧自由基的生產、細胞內鈣超載、中性粒細胞激活、凋亡基因的調控、內皮素等介導的腎小管、腎小球細胞損傷等具有密切關系[3]。

病理過程中，氧自由基對組織的氧化損傷起重要作用。由氧誘發的自由基稱為氧自由基或活性氧，如超氧陰離子、羥自由基及單線態氧等非脂性自由基。黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XO)及其前身為黃嘌呤脫氫酶(Xanthine dehydrogenase，XD)，二者主要存在毛細血管內皮細胞內。正常時XD占90%，XO只占10%。組織缺血、缺氧，使ATP減少，膜泵失靈，離子轉運功能障礙，Ca2+進入細胞增多，激活鈣依賴性蛋白酶，使XD轉變為黃嘌呤氧化酶XO。同時因缺血缺氧，ATP依次降解為ADP、AMP、腺苷和次黃嘌呤，次黃嘌呤自身不能代謝生成黃嘌呤，使得次黃嘌呤大量蓄積。再灌注時，隨著血液的進入，缺血組織重新得到氧，在缺血時大量蓄積的次黃嘌呤在XO的作用下形成黃嘌呤，繼而又催化黃嘌呤轉化為尿酸，這兩步反應都有電子轉移，以分子氧作為電子受體，氧分子可得到電子，生成大量超氧陰離子自由基(氧自由基)。而此時腎臟內的SOD、過氧化氫酶(CAT)等因為缺血缺氧，清除氧自由基的能力下降。氧自由基大量蓄積，氧自由基和脂性自由基的性質極為活潑，易于失去電子(氧化)或奪取電子(還原)，特別是其氧化作用強，故具有強烈的引發脂質過氧化損傷的作用，它最易損傷膜脂質，導致鈣泵、鈉泵等膜蛋白功能受到損傷，發生細胞腫脹和鈣超載，細胞信號轉導發生障礙。Araujo等[4]研究證實，氧自由基在腎IRI中起了非常重要的作用，是腎臟再灌注損傷的重要介質。氧化損傷也可使細胞產生凋亡，Chatterjee等[5]發現IRI能引發廣泛的細胞凋亡現象。

國內外許多學者將具有抗氧化作用的藥物應用于缺血再灌注損傷的研究。SOD是組織產生的清除氧自由基的重要酶之一，和其他抗氧化劑協同作用將超氧陰離子歧化為H2O2，進而轉變為H2O，從而使得超氧陰離子對生物體細胞損傷作用消失，起到保護作用。SOD反映機體清除氧自由基的能力，是抗氧化指標之一。MDA是脂質過氧化的代謝產物。通過檢測MDA含量可以估計腎組織中脂質過氧化反應的強弱。

刺五加注射液是純天然五加科植物刺五加的莖葉經水醇法提取，利用現代科學技術精制而成，主要成分為總黃酮，能擴張血管，降低血液粘稠度[6]，促進血液循環，減少組織耗氧量和組織代謝，有抗疲勞、抗應激、抗炎[7]作用，能清除氧自由基及提高人體超氧化物歧化酶活性及清除氧自由基的能力。很多動物實驗研究表明，刺五加注射液對缺血再灌注的心臟、腦、肝臟、腸、肢體均具有保護作用[8-10]，其作用機制與其清除氧自由基、防止脂質過氧化有關。其用于腎臟缺血再灌注損傷的研究尚無報道。本試驗結果：從IRI 5 h組和IRI 10 h組相比較結果可見，大鼠腎IRI模型建立后，腎功能發生明顯障礙，而且在早期的一段時間內(5 h、10 h)，BUN、Scr逐漸升高，腎功能障礙逐漸加重。從AS組、IRI組分別與Control組相比較結果可見，BUN、Scr均明顯升高，說明造模較成功，AS組、IRI組大鼠腎功能均發生明顯障礙。進一步看AS組與IRI組相比較的結果，AS組BUN、Scr均降低，可見AS預處理可使大鼠腎IRI后腎功能明顯改善，起到保護作用。HE染色可見Control組腎小球、腎小管結構清晰，無水腫、炎細胞浸潤、細胞變性、管腔狹窄等病理改變；IRI組出現明顯病理改變，其腎小球形態結構變化不明顯，病變主要集中在腎小管，可見到腎小管上皮細胞空泡變性，細胞脫落，炎性細胞浸潤明顯，部分腎小管可見細胞碎片，腎間質水腫、充血、炎癥細胞浸潤，說明造模后由于IRI導致大鼠腎臟出現明顯病理改變；而AS組主要病理表現為腎小管變性，細胞脫落較IRI組減少，腎間質水腫、充血、炎性浸潤等病理改變較IRI組明顯減輕，考慮AS預處理對缺血再灌注損傷起到保護作用，病理改變明顯減輕。從AS組、IRI組分別與Control組相比較結果可見：大鼠腎組織的MDA水平均明顯升高，而SOD活性均明顯降低，提示大鼠腎IRI后脂質過氧化反應增強，內源性自身抗氧化能力減弱。而從AS組與IRI組相比較結果可見：AS組較IRI組MDA水平明顯降低，SOD活性顯著升高，可看出組織抗氧化能力提高，氧化損傷反應減輕。

綜合以上試驗結果，我們考慮AS預處理可對大鼠腎缺血再灌注損傷起到保護作用，其機理可能與其有抗氧化作用，能提高細胞的抗氧化能力，減輕氧自由基大量釋放導致的組織脂質過氧化反應，而產生保護作用。由于缺血再灌注損傷病理機制極其復雜，AS預處理對于其的保護作用，還需要進一步、多方面試驗進行觀察。

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[5]Chatterjee PK,Brown PA,Cuzzocrea S,et al.Calpain inhibitor reduces renal ischemia reperfusion injury in the rat[J].Kidney International,2001,59(6):2073-2083.

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Effect of Aeanthopanax senticosus pretreatment on acute renal ischemia-reperfusion injury in rats.

LI Qiang, JIN Shu-bin,LI Feng,HUO Shao-jun,ZHANG Rui-gang.Department of Urology,Handan Central Hospital,Handan 056001,Hebei,CHINA

ObjectiveTo observe the protective effect of Aeanthopanax senticosus(AS)and discuss its possible mechanism on rats with acute renal ischemic reperfusion injury(IRI).MethodsRats with acute renal ischemia reperfusion injury model were constructed by single-artery occlusion.Thirty-six healthy male SD rats were selected and randomly divided into six groups:Control 5 h group,Control 10 h group,IRI 5 h group,IRI 10 h group,AS 5 h group,AS 10 h group.In Control group,right kidney was removed.In IRI and AS group,right kidney was removed, and the left renal was occlusived for 45minutes.AS 5 h group,AS group rats were injected 100 mg/kg AS intraperitoneally once per day in the 5 days before surgery and 30minutes before surgery.Control group and IRI group rats were injected saline at the equivalent dose at the same time.Venous blood and left kidney tissue were taken at corresponding time point(5 h and 10 h)in each group.The levels of Scr and BUN were measured,as well as SOD and MDA activity of kidney tissue.Pathological changes of renal tissue were observed by H-E staining technique.ResultsPathological changes of renal tissue were lighter in AS group than IRI group.Compared with Control group,BUN,Scr levels in IRI were significantly increased(P＜0.05),with SOD decreased and MDA increased(P＜0.05).Compared with IRI group,Scr,BUN,MDA in AS group were significantly lower(P＜0.05).ConclusionAeanthopanax senticosus could protect the kidney against renal ischemia reperfusion injury,which might be realized by its antioxidant.

Aeanthopanax senticosus;Renal ischemia reperfusion injury;Superoxide dismutase;Malondialdehyde

R-332

A

1003—6350（2015）04—0475—04

2014-08-13)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.04.0174

李 強。E-mail：xinghuoliqiang@163.com