萬(wàn)源粗榧中高三尖杉酯堿的含量測(cè)定

劉丹，陳安銀，楊莉，賀正濤

(四川文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 達(dá)州 635000)

高三尖杉酯堿是從粗榧屬植物中提取出具有抗癌作用的生物活性酯堿，是一種天然來(lái)源的抗腫瘤藥物［1］?；谔烊豢鼓[瘤藥物高三尖杉酯堿副作用相對(duì)較小的優(yōu)勢(shì)，廣泛用于惡性腫瘤，其中對(duì)白血病的緩解率高達(dá)82%，對(duì)淋巴肉瘤、肺癌等有較好的療效，而且安全有效［2］。進(jìn)入新世紀(jì)以來(lái)許多抗腫瘤藥物如順鉑、卡鉑等都是人工合成的［3］，其他一些是人工半合成藥物，極少數(shù)天然來(lái)源的抗腫瘤藥物一般都是中藥，如人參皂苷Rh2 等，天然的確定結(jié)構(gòu)的西藥抗腫瘤藥物是非常少見的，因此開發(fā)高三尖杉酯堿是當(dāng)前研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)有國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法為紫外-可見分光光度法，面對(duì)天然提取物種類繁多的實(shí)際情況，其檢測(cè)準(zhǔn)確程度已不能滿足現(xiàn)代醫(yī)藥企業(yè)測(cè)定要求［4］。建立高效液相色譜法對(duì)新發(fā)現(xiàn)的萬(wàn)源粗榧提取的高三尖杉酯堿含量進(jìn)行測(cè)定，利于中藥資源開發(fā)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

甲醇、醋酸銨(0.1 mol/L)均為色譜純;乙醇、冰醋酸、氨水、氯仿、乙酸乙酯、丙酮均為分析純;高山尖杉酯堿標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(sigma 公司，含量99%);萬(wàn)源粗榧。

Agilent-1100 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm);YQ-010 超聲波清洗儀;TGL-16G-A 離心機(jī);FA1204B 電子分析天平;0.45 μm 濾膜。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil GOLD C18(150 mm × 4. 6 mm，5 μm)，流 動(dòng) 相 為 醋 酸 銨(0.1 mol/L)和甲醇混合液體(體積比為47 ∶53)，用36%醋酸調(diào)pH 值7 ～8，流動(dòng)相流速1.0 mL/min，高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm。

1.2.2 樣品制備 稱定干燥粗榧樹皮粉末10 g，置于250 mL 磨口三角瓶中，加入40% 濃度的氨水5 mL，搖勻，加氯仿50 mL，搖勻，超聲輔助提取2 h［5］，室溫靜置2 h，過(guò)濾，氯仿15 mL 分3 次洗滌濾渣，合并濾液，減壓蒸干［5］，甲醇溶解至1 mL，離心，清液過(guò)0.45 μm 濾膜，按1.2.1 節(jié)色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中高三尖杉酯堿的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件分析

2.1.1 色譜柱的選擇 由于從粗榧中提取到的高三尖杉酯堿伴有大量堿性結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)分子，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有相似性，故采用Hypersil GOLD C18(150 mm×3.9 mm，5 μm)反相色譜柱進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果表明，分離效果好、靈敏度較高。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 用醋酸銨(0.1 mol/L)和甲醇混合液體體積比例為40 ∶60，45 ∶55，47 ∶53，50 ∶50，55 ∶45，60 ∶40 分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，綜合考慮分離程度和保留時(shí)間，故選用醋酸銨(0.1 mol/L)和甲醇的比例為47 ∶53 作為此次實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.1. 3 流 速 的 選 擇 用0. 5，0. 8，1. 0，1. 3，1.5 mL/min 5 種流速做實(shí)驗(yàn)，1.0 mL/min 流速保留時(shí)間適中，分離效果相對(duì)較好，能滿足實(shí)驗(yàn)要求，故選用此流速。

2.2 高三尖杉酯堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取50 mg 高三尖杉酯堿標(biāo)準(zhǔn)品，定容為50 mL，配制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取1.2，3.0，6.0，9.0，12.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液定容為10 mL，進(jìn)樣20 μL，按1.2.1 節(jié)色譜條件測(cè)定，得到高三尖杉酯堿的最佳相對(duì)保留時(shí)間為3.751 min，其對(duì)應(yīng)濃度的峰面積積分見圖1。

圖1 高三尖杉酯堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve Homoharringtonine base

以高三尖杉酯堿濃度C(mg/L)，對(duì)峰面積A 進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程式y(tǒng) = 0. 364 249x +1.661 89 及相關(guān)系數(shù)R2=0.999 94。結(jié)果表明，所測(cè)溶液高三尖杉酯堿溶液的濃度(x)與峰面積(y)的線性關(guān)系良好，R2＞0.999。

2.3 高三尖杉酯堿的樣品測(cè)定

稱定萬(wàn)源地區(qū)干燥粗榧樹皮粉末10 g，按1.2.2節(jié)樣品處理方法提取高三尖杉酯堿及其他活性混合物，清液過(guò)0.45 μm 濾膜后直接進(jìn)樣20 μL，按1.2.1節(jié)色譜條件測(cè)定，得到相對(duì)保留時(shí)間為3.751 min時(shí)峰面積積分為:378.856 4，帶入回歸方程式y(tǒng) =0.364 249x+1.661 89，可得高三尖杉酯堿含量為1 036 mg/L，樹皮中含量為0.010 36%，高于文獻(xiàn)［6］中大部分地區(qū)的高三尖杉酯堿含量。樣品中回收率結(jié)果見表1，回收率為97.02% ～99.74%。

表1 樣品加標(biāo)回收率Table 1 Sample recoveries

3 結(jié)論

本文利用高效液相色譜法測(cè)定了高三尖杉酯堿含量，并運(yùn)用于萬(wàn)源地區(qū)粗榧中高三尖杉酯堿的含量，結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度較高，適用于高三尖杉酯堿的測(cè)定。

［1］ 阮磊，王艷紅，文漢.高三尖杉酯堿注射液含量的毛細(xì)管電泳法測(cè)定［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008(5):70-72.

［2］ 耿瑩瑩，闕慧卿，鄧思珊，等. 高效液相色譜法測(cè)定組織培養(yǎng)株中高三尖杉酯堿的含量［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2006(3):238-239.

［3］ 封宇飛，劉志鶴，胡欣，等. 高效液相色譜法測(cè)定高三尖杉酯堿氯化鈉注射液含量及其有關(guān)物質(zhì)的限量［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2002(4):12-14.

［4］ 林筱華.抗癌物質(zhì)高三尖杉酯堿的提取和研究［J］.龍巖師專學(xué)報(bào)，1992(3):144-146.

［5］ 李輝，胡文彬，李亞男，等.超聲提取-高效液相色譜法測(cè)定粗榧中高三尖杉酯堿［J］. 理化檢驗(yàn):化學(xué)分冊(cè)，2009(4):466-467，470.

［6］ 朱太平，馬彥卿. 不同產(chǎn)地三尖杉中三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿的含量測(cè)定［J］.廣西植物，1987(4):347-349.