一株產普魯蘭酶芽孢桿菌的篩選鑒定及發酵條件優化

宋勇強，胡先望，張鳴明，嚴曉娟，沙芮，梁寧

(甘肅省商業科技研究所，甘肅 蘭州 730010)

普魯蘭酶(pullulanase，EC.3.2.1.41)是應用最廣泛的一類脫支酶［1］，因為能水解普魯蘭糖分子中的α-(1→6)糖苷鍵而得名［2］，能夠專一性地作用于糊精分子和支鏈淀粉，有效地切開其中分支點處的α-(1→6)糖苷鍵，將各分子支鏈脫落［3］，最終使糊精分子或支鏈淀粉轉變為只含有α-(1→4)糖苷鍵的直鏈低聚糖或支鏈淀粉。由于這類脫支酶能夠分解最小單位的支鏈，有效地提高了淀粉利用率，因此在淀粉加工工業中有著重要的應用價值和廣闊的市場前景，是實際應用非常廣泛、市場需求量相對較大的一類酶［4-5］。

在1943 年，科學家Myrback 首次發現植物普魯蘭酶，1961 年，微生物普魯蘭酶被Wallenfels 和Bender 通過產氣氣桿菌Aerobacter aerogenes(典型菌為肺炎克雷伯氏桿菌)發酵獲得［5］。之后，各國微生物及酶工程領域的相關專家和科研人員開始對微生物普魯蘭酶及其應用展開了更為深入的研究，并且在不同地區陸續發現了許多能夠產生該類酶的不同種屬的微生物，并篩選出了其中一些適用于工業化大生產的優良菌株，如熱球菌屬的Thermococcus hydrothermalis［6］、鏈霉菌屬的Streptomyces flavochromogenes［7］、厭 氧 分 支 桿 菌 屬 的Anaerobranca gottschalkii［8］、克雷伯氏菌屬的Klebsislla aerogenes［9］、芽孢桿菌屬的Bacillus flavocaldarius［10］、火球菌屬的Pyrococcus woesei［11］、鏈球菌屬的Streptococcus pneumonia［12］等。

目前，國內淀粉工業中使用的普魯蘭酶大多都是從國外進口，價格昂貴、成本太高，迫切需要國內科研人員篩選出能夠應用于工業化生產的優良普魯蘭酶酶源菌并對其發酵生產的普魯蘭酶進行應用研究工作，力爭研究和開發出我國自主知識產權的普魯蘭酶酶產品，以擺脫對國外進口的依賴。經過這些年的努力和研究，國內已有一些實驗室通過純培養或者基因重組的方法篩選得到了一些產普魯蘭酶優勢酶源菌，包括產氣氣桿菌［13］、嗜熱厭氧菌［14］、厭氧古細菌［15］、嗜熱芽孢桿菌［16］、棲熱水生菌、多粘芽孢桿菌等，但是還未見報道通過實驗方法篩選獲得解淀粉芽孢桿菌屬來源的普魯蘭酶，本研究從甘肅定西淀粉加工廠附近的土壤中分離得到一株產普魯蘭酶優勢菌株AI-1，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并對其發酵產酶條件做了進一步的研究。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

以甘肅省定西市某淀粉加工廠附近的土壤作為試驗分離材料，分離出一株產酶活性較高的普魯蘭酶酶源菌AI-1。

酵母膏、牛肉膏、蛋白胨均為生物試劑;曲里苯藍、普魯蘭糖均為優級純;氫氧化鈉、氯化鈉、可溶性淀粉、無水葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀均為分析純。

DK-S12 電熱恒溫水浴鍋;FA1204B 電子分析天平;LDZM-75 型立式智能壓力蒸汽滅菌器;SW-CJ-1FD 型單人單面凈化工作臺;HG303-4A 電熱恒溫培養箱;TU-1800pc 紫外可見分光光度計;GL-21M湘儀離心機;PHS-3C 型酸度計;eppendorf 移液槍;THZ-82N 臺式恒溫振蕩器培養箱。

1.2 培養基

1.2.1 平板分離培養基(LBSP 培養基) 蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，瓊脂1.5%，普魯蘭糖0.01%，曲里苯藍0.01%，用5 mol/L NaOH 調pH至7.0，0.1 MPa 滅菌30 min。

1.2.2 分離純化培養基 可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0. 5%，K2HPO40. 1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH 7.0，0.1 MPa 滅菌30 min。

1.2.3 種子培養基 酵母膏1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 7.0 ～7.2，0.1 MPa 滅菌30 min。

1.2.4 搖瓶發酵培養基 可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0. 5%，K2HPO40. 1%，酵 母 膏1. 5%，MgSO4·7H2O 0. 05%，pH 7. 0，0. 1 MPa 滅 菌30 min。

1.2.5 斜面保藏培養基 蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH 7.0，0.1 MPa 滅菌30 min。

1.3 菌株篩選［17］

裝有9 mL 無菌水的試管中，加入含土樣的菌液1.0 mL，梯度稀釋獲得濃度分別為10－4，10－5，10－6，10－7的菌懸液。從中任意選取3 個稀釋度，用Eppendorf 移液槍準確吸取1 mL 于干凈無菌的培養皿中(每一個稀釋梯度做2 個平行)，將溫度冷卻到45 ℃左右的平板分離培養基溶液倒入無菌培養皿中，每個培養皿倒入12 ～15 mL，搖勻，待培養皿中的瓊脂培養基凝固后，在恒溫恒濕培養箱中30 ℃下倒置培養48 h。采用曲里苯藍法篩選產普魯蘭酶酶源菌。當產普魯蘭酶酶源菌代謝產生普魯蘭酶時，會水解培養基成分中的普魯蘭多糖，使得菌株周圍的藍色褪去，出現透明圈。從分離培養基上挑取菌落形態一致，H/C 值(透明圈直徑與菌落直徑的比值)較大的單菌落，劃線純化后于接種于斜面保藏培養基上保藏。進行酶活力測定和形態及生理化鑒定。

普魯蘭酶活性定義:在50 ℃，pH 值6.0 條件下，每分鐘催化分解普魯蘭糖產生1 μmol 葡萄糖所需的酶量為1 個酶活單位，以U/mL 表示。

1.4 制作葡萄糖標準曲線

精確稱量葡萄糖(105 ℃溫度下干燥恒重)0.100 0 g，在 100 mL 容 量 瓶 中 配 制 成 濃 度1.0 mg/mL的母液。用移液槍準確量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL 母液于9 支試管中，用pH 6.0 濃度0.02 mol/L 的醋酸-醋酸鈉緩沖液補充至2 mL。加入1.0 mL DNS(3，5-二硝基水楊酸)溶液，在沸水浴中放置5 min。冷卻，定容到15 mL，用紫外分光光度計測量波長540 nm 下的OD540nm值(每管中的溶液做3 次平行，取平均值)。以葡萄糖的濃度(mg/mL)為橫坐標、OD540nm值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線圖(圖1)，得到回歸方程Y =0.926 2X+ 0.032，R2=0.997 2。

圖1 葡萄糖含量標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.5 普魯蘭酶酶活力測定

采用DNS 法(3，5-二硝基水楊酸法)測定普魯蘭酶活性。裝有1.0 mL 0.5%的普魯蘭糖溶液的試管中，加入1.0 mL 濃度0.02 mol/L pH 6.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液，1.0 mL 普魯蘭酶酶液(即處理后的菌種發酵液)，在恒溫水浴鍋中50 ℃下反應20 min。加入1.0 mL DNS 溶液，沸水浴5 min。冷卻后，加蒸餾水定容至15 mL，振蕩搖勻后測OD540nm值。

酶活力(U/mL)=［(Y－0.032)/0.926 2］×Df×1 000/(180 ×t)

式中，Y 為吸光度值OD540nm;Df 為待測酶液的稀釋倍數;t 為反應時間(min);180 為葡萄糖的分子量;1 000 為單位換算倍數。

1.6 形態及生理生化鑒定

依據《常見細菌系統鑒定手冊》［18］和《伯杰細菌鑒定手冊(第八版)》［19］對產普魯蘭酶菌株進行初步鑒定。

1.7 菌株16S RNA 序列鑒定及系統發育樹構建［20］

挑取純化后的普魯蘭酶酶源菌單菌落接種于裝有10 mL 發酵培養基的三角瓶中，放入恒溫振蕩培養箱中，在溫度30 ℃，轉速150 r/min 的條件下振蕩培養24 h。用移液槍準確的吸取2 mL 菌液，在低溫高速冷凍離心機中以12 000 r/min 離心2 min，去除上清液，按照生工SK1201-UNIQ-10 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒說明書的試驗步驟提取菌株的基因組DNA，作為模板。

首先進行16S rDNA 的擴增，采用引物(上游:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’;下游:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，建 立 PCR 反 應 體 系(25 μL):上游引物0.5 μL;下游引物0.5 μL;Template(基因組)1 μL;dNTP 0.5 μL;Taq (5 U/μL)0.2 μL;10 ×反應緩沖液2.5 μL;最后加水補充至25 μL。

設定PCR 程序:在高溫94 ℃下預變性5 min 后進入循環程序:94 ℃下變性30 s，55 ℃下退火35 s，72 ℃下延伸1 min，共計35 個循環，最后在72 ℃下保溫8 min。

用Eppendorf 移液槍準確地吸取50 μL 進行2% 瓊脂糖凝膠電泳，根據PCR 產物電泳結果切割所需DNA 目的條帶，純化以后進行后續DNA 的測序工作，將提取的基因組DNA 委托上海生工生物工程有限公司進行16S rDNA 基因擴增序列測序。在GenBank 數據庫中提交測序結果，通過BLAST 程序提交得到的16S rRNA 序列，最后在NCBI 在線數據庫中進行同源序列檢索。將目標菌株的16S rDNA和在BLAST 程序中檢索到的與之有較高同源性的模式菌株的16S rDNA 作最大同源性比較分析，并利用系統發育軟件MEGA 4.0 采用鄰位相鄰法構建系統發育樹，同時進行重復次數為1 000 次的Bootstrap 測試，最終確定目標菌株的分類地位。

2 結果與討論

2.1 產普魯蘭酶菌株篩選

在所采集的土壤中，共分離出在曲里苯藍培養基上產生透明圈的菌株12 株，其中菌株AI-1 的H/C 值最大。

將產普魯蘭酶酶源菌經分離純化后，接種到搖瓶發酵培養基中30 ℃、150 r/min 振蕩培養72 h，測定發酵液中普魯蘭酶的酶活，結果見圖2。

圖2 菌株發酵產酶能力比較Fig.2 The comparison of several strains in fermentation enzyme

由圖2 可知，所選菌株在搖瓶發酵液體培養時都能產生胞外普魯蘭酶，其中，菌株AI-1 的酶活達到了2.45 U/mL，而其他菌株所產的普魯蘭酶酶活均低于2.0 U/mL;故選取菌株AI-1 作為目標菌株，進行發酵條件優化等一系列后續研究。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 AI-1 菌株個體形態 菌株AI-1 革蘭氏染色呈陽性，其顯微鏡下的鏡檢形態見圖3。

2.2.2 菌落群體形態 在平板培養基上生長的菌株AI-1 的菌落呈白色(圖4)，單個菌落近似圓形，邊緣較整齊，半透明，菌落表面光滑濕潤。

圖3 菌株AI-1 的鏡檢形態Fig.3 The micrograph of bacterial strain AI-1

圖4 AI-1 的平板培養菌落形態Fig.4 Colonial morphology of bacterial strain AI-1

由圖3 可知，菌體形態為長桿狀，大小為0.8 μm×3.2 μm，形成芽孢，芽孢呈現卵圓形，單個或成鏈排列。

2.2.3 菌株生理生化鑒定 菌株AI-1 的生理生化特征見表1。

表1 菌株AI-1 的生理生化特征Table 1 The physiological and biochemical characteristics of bacterial strain AI-1

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)中提供的檢索表和《常見細菌系統鑒定手冊》分類系統中的描述，對比菌株AI-1 的鏡檢、平板形態特征及其一系列菌株生理生化鑒定結果，初步鑒定菌株AI-1屬于芽孢桿菌屬。

2.2.4 菌株16S rRNA 基因序列鑒定及構建系統發育樹 由圖5 可知，經電泳檢測，其PCR 產物為一個大小約為1 400 bp 的特異性片段，菌株AI-1 的16S rRNA 全長序列大小為1 451 bp。在NCBI 在線數據庫中進行序列比對的過程中發現，其與Bacillus屬中編號為HE716936.1 的菌株Bacillus amyloliquefaciens 的同源性高達到99.6%，借助構建系統發育MEGA 4.0 軟件生成直觀清晰的系統發育樹見圖6。

圖5 菌株AI-1 的PCR 產物電泳圖譜Fig.5 The electrophoresis pattern of PCR products of bacterial strain AI-1

圖6 菌株AI-1 的系統發育樹Fig.6 The system evolutionary tree of strain AI-1

由圖6 可知，菌株AI-1 與Bacillus amyloliquefaciens(KJ009413.1)處在同一個分支上，通過1 000次bootstrap 測試分析支持該分支;并且在GenBank數據庫比對過程中發現，菌株AI-1 與模式菌株Bacillus amyloliquefaciens(KJ009413.1)的16S rRNA 基因序列相似度為99.6%。由此推斷，菌株AI-1 為Bacillus 屬中的Bacillus amyloliquefaciens。

綜上所述，結合菌株形態學特征、生理生化試驗結果和菌株16S rRNA 序列分析鑒定及系統發育分析結果，最終將菌株AI-1 鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

2.3 發酵產酶培養基及發酵條件的優化

圖7 不同碳源對產酶的影響Fig.7 The effect of different carbon sources on enzyme production

2.3.1 碳源種類對發酵產酶的影響 在培養基中加入不同類型的碳源對菌株產生普魯蘭酶的影響見圖7。由圖7 可知，在培養基中加入可溶性淀粉的效果最好，可以使胞外酶活達到4.16 U/mL 的水平;其次是支鏈淀粉，酶活達3.86 U/mL;而在使用葡萄糖或者蔗糖作為碳源時，酶活卻很低。此外，使用普魯蘭糖、馬鈴薯淀粉或者玉米淀粉作為碳源時，也能產生較高酶活的普魯蘭酶。因此，也間接的證明了普魯蘭酶是一種誘導型的酶，只有當環境中存在含有α-(1→6)糖苷鍵的誘導物時，普魯蘭酶才能得到合成，并具有較高的酶活。

2.3.2 可溶性淀粉濃度對發酵產酶的影響 可溶性淀粉的添加量對菌株產酶能力的影響見圖8。

圖8 可溶性淀粉濃度對產酶的影響Fig.8 Effect of different concentrations of soluble starch on Pullulanase production

由圖8 可知，可溶性淀粉的添加量(即碳源的濃度)對菌株產酶能力有顯著影響，添加量過少，不僅滿足不了菌體生長所需要的能量，而且也不能充分地誘導菌株發酵產生普魯蘭酶;添加量過多，同樣不利于普魯蘭酶的積累，雖然理論上可以為菌株產酶提供更多的作用底物和生長所需能量，但高濃度的碳源底物反而會由于底物抑制的緣故對菌株產酶產生抑制作用。當可溶性淀粉的濃度到達1.5 g/mL 時，酶活最高，繼續增加可溶性淀粉的濃度，酶活則開始降低。

2.3.3 不同種類的氮源對發酵產酶的影響 幾種常見的有機氮源和無機氮源對菌株產酶的影響見圖9。

圖9 不同種類氮源對產酶的影響Fig.9 The effect of different nitrogen sources on enzyme production

由圖9 可知，有機氮源中的酵母膏對菌體的生長和產酶優于其他氮源，蛋白胨其次;與無機氮源如硝酸銨、醋酸銨等相比，有機氮源(如酵母膏、蛋白胨)更有利于菌體發酵產酶，而在試驗過程中也發現，當在發酵培養基中添加了無機氮源以后，隨著無機氮源的被利用，發酵培養基的pH 值也會發生變化，從而引起菌體生長環境酸堿度的變化，對菌體發酵產酶產生一定的影響。所以，為了避免菌體生長環境pH 發生變化，宜選取有機氮源作為菌體生長和發酵所需的氮源。

2.3.4 酵母膏濃度對發酵產酶的影響 酵母膏的添加量對普魯蘭酶產生的影響見圖10。

圖10 酵母膏濃度對產酶的影響Fig.10 Effect of different concentrations of yeast extract on Pullulanase production

由圖10 可知，隨著酵母膏濃度的增大，菌體所產普魯蘭酶的酶活也隨之增大，濃度1.0 g/mL 時，酶活達到最大;之后隨著酵母膏濃度的繼續增大，普魯蘭酶的酶活開始呈下降趨勢，這可能是由于加入的氮源量過多時，會導致微生物菌體的生長繁殖過快，不利于代謝產物普魯蘭酶的積累。

有關研究表明［21］，產酶微生物添加復合氮源時，產酶的效果要優于單一氮源，而且有機氮源優于無機氮源，并且在考察不同氮源對普魯蘭酶的影響中發現，蛋白胨與其他有機氮源如酵母膏、牛肉膏等組合作為微生物菌體氮素的來源時，菌體在培養基中的生長代謝更旺盛、發酵產酶能力更佳，而且蛋白胨不僅富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類，作為微生物培養基的成分，十分有利于微生物菌株的生長代謝［22］。因此，本研究也考察了單一有機氮源與復合有機氮源對菌株發酵產酶的影響，即在單一氮源的基礎上添加1%的蛋白胨作為復合有機氮源的組合，結果見圖11。

由圖11 可知，產酶微生物在添加復合氮源的發酵培養基中產酶效果要優于只添加單一碳源的培養基，而其中酵母膏和蛋白胨的組合對于菌株產酶效果最佳，酶活可達4.0 U/mL 以上。

圖11 復合氮源對產酶的影響Fig.11 The effect of complex nitrogen sources on enzyme production

2.3.5 培養溫度對發酵產酶的影響 培養溫度對普魯蘭酶產量的影響見圖12。

圖12 培養溫度對產酶的影響Fig.12 The effect of temperature on enzyme production

由圖12 可知，當溫度從30 ℃升高到36 ℃左右時，菌體發酵液中的酶活力隨著溫度的升高而增大，之后，隨著溫度的繼續升高酶活力呈急劇下降趨勢，到達50 ℃時發酵液中的普魯蘭酶接近失活。

2.3.6 發酵培養基的初始pH 對發酵產酶的影響培養基初始pH 對產酶的影響見圖13。

圖13 發酵培養基初始pH 對產酶的影響Fig.13 The effect of initial pH culture medium on enzyme production

由圖13 可知，菌株所產普魯蘭酶的酶活隨著pH 的增大而增大，pH 為7.0 左右時，酶活力達到最大;之后，隨著pH 的繼續增大，酶活呈現急劇下降趨勢。

2.3.7 發酵時間對發酵產酶的影響 將接種菌株AI-1 的種子液接入裝有100 mL 搖瓶發酵培養基的250 mL 容量三角瓶中，在30 ℃、150 r/min 恒溫振蕩培養箱中進行培養，每隔6 h 取樣在600 nm 波長下測定培養液的吸光值(以OD600 表示)，以未加菌液的培養液作為空白液，結果見圖14。

圖14 菌株AI-1 生長曲線Fig.14 The growth curve of strain AI-1

由圖14 可知，解淀粉芽孢桿菌AI-1 在經歷了短暫的延遲期之后，在培養18 h 之后進入對數生長期(18 ～60 h)，菌體生長速率加快、代謝旺盛，培養基中的菌數倍增;之后菌株進入生長穩定期(60 ～84 h)，通常在此時期，大多數細菌開始進行一系列的次級代謝反應，從而產生大量的次生代謝物(如抗生素、乳酸等)，因此此時期又可以被稱作代謝產物合成期，一般在生產實踐中穩定期的生長規律具有重要的指導意義;繼續培養84 h 以后，菌株的生長進入衰亡期，菌體數量開始呈現下降趨勢，個體死亡速度超過新生速度，整個群體呈現負生長狀態。

根據上述測定結果，試驗中將種子培養液以2%的接種量接入裝有100 mL 搖瓶發酵培養基的250 mL 容量三角瓶中，在前面篩選的最佳發酵條件下分別培養42，48，54，60，66，72，78，84 h，測定不同發酵時間段內發酵液中的酶活力，以確定最佳發酵周期，結果見圖15。

圖15 發酵時間對產酶的影響Fig.15 The effect of fermentation time on enzyme production

由圖15 可知，在菌株發酵培養的開始階段，發酵所產的普魯蘭酶活力較低，但是隨著菌體大量生長繁殖，發酵液中所產生的普魯蘭酶酶活力也隨著菌體細胞數量的增加而不斷地增大，在發酵60 h 以后，菌體細胞的生長繁殖進入穩定期，此時酶活仍然呈現出增大的趨勢，直到在發酵72 h 時，發酵液中的酶活力達到最大，此后酶活力略有下降。

2.3.8 接種量對發酵產酶的影響 菌體接種量對發酵產酶的影響見圖16。

圖16 菌體接種量對發酵產酶的影響Fig.16 The effect of amount of inoculation on enzyme production

由圖16 可知，當菌體的接種量小于8%時，發酵液中普魯蘭酶酶活會隨著接種量的增大而增高;接種量8%時，發酵液中的普魯蘭酶酶活達到最高，繼續增大接種量，酶活力呈現出明顯的下降趨勢。這是因為接種量的高低會影響到接種后微生物在培養基中營養物質消耗的速率，從而影響菌株發酵產酶。當接種量過小時，菌體細胞密度小，菌體生長繁殖緩慢，發酵遲緩，產酶受限;當接種量過大時，由于菌體數量太大，導致培養基中的營養物質和能量消耗過快，容易造成培養環境缺氧和菌體過快衰老，從而不利于代謝產物酶的積累。因此，選擇接種量8%(V/V)為最適接種量。

2.3.9 搖床轉速對發酵產酶的影響 搖床轉速對發酵產酶的影響見圖17。

圖17 搖床轉速對產酶的影響Fig.17 The effect of shaker speed on enzyme production

由圖17 可知，菌株AI-1 發酵液中的普魯蘭酶酶活隨著搖床轉速的增大而增高，當搖床轉速150 r/min 時，酶活達到最大;之后，隨著搖床轉速的繼續增大，酶活略有下降，但基本趨于穩定。其原因是當搖床轉速達到150 r/min 時，發酵液中溶液氧的濃度已經能夠滿足菌體的生長需求，即達到了溶解氧的供需平衡。因此，菌株AI-1 發酵的最適搖床轉速確定為150 r/min。

綜上所述，菌株AI-1 的最適培養基和最佳發酵培養條件為:可溶性淀粉1.5%，酵母膏1%，蛋白胨1%，NaCl 0. 5%，K2HPO40. 1%，MgSO4·7H2O 0.05%，培養溫度36 ℃，發酵培養基初始pH 7.0，接種量8%(V/V)，搖床轉速150 r/min，發酵周期72 h。在此優化發酵條件下，對菌株AI-1 進行培養發酵產酶酶活測定，重復3 次，結果見表2。

表2 優化條件下菌株AI-1 的產酶酶活Table 2 The enzyme activity produced by strain AI-1 under optimal conditions

由表2 可知，通過對菌株發酵培養及成分的調整與發酵條件的優化［23］，菌株AI-1 所產普魯蘭酶酶活力由最初的2.35 U/mL 提高到了4.52 U/mL。

3 結論

從甘肅省定西市境內某淀粉加工廠附近的土壤中分離得到一株產普魯蘭酶優勢酶源菌AI-1，通過形態學、生理生化試驗及16S rRNA 序列鑒定并對其進行系統發育分析，最終鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。其最佳產酶發酵培養基為:可溶性淀粉1.5%，酵母膏1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%;最佳發酵條件為:培養溫度36 ℃，發酵培養基初始pH 7.0，接種量8%(V/V)，搖床轉速150 r/min，發酵周期72 h。在此優化條件下，菌株AI-1 發酵所產普魯蘭酶的酶活由最初的2. 45 U/mL 提高到4.52 U/mL，酶活提高84.5%，為我國淀粉加工工業的酶制劑生產提供了新的菌種資源，并為傳統發酵生產酶制劑工藝的現代化改造和技術升級提供理論依據和參考。

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