我院ICU環境多重耐藥鮑曼不動桿菌基因多樣性檢測

賈 寧，于季紅，謝麗君，索繼江，邢玉斌，劉運喜

解放軍總醫院 感染管理與疾病控制科，北京 100853

鮑曼不動桿菌屬于條件致病菌，易寄生于人體或環境，生存能力強。自從1991年美國首次報道多重耐藥鮑曼不動桿菌院內感染和流行以來，世界各國先后報道多重耐藥鮑曼不動桿菌的流行和播散[1-2]。目前有關醫院感染鮑曼不動桿菌的研究多集中于病人分離的菌株，醫院環境中的多重耐藥鮑曼不動桿菌的基因多樣性及與病人分離株的相關性，相關報道很少。鑒于重癥監護病房收治病人病情重、住院時間長、多重耐藥菌感染多，醫院環境易受污染。為此，我們收集了2010年10月- 2011年10月分離自我院3個重癥監護病房環境的多重耐藥鮑曼不動桿菌株，比較菌株間DNA指紋圖譜，進而明確我院ICU環境中多重耐藥鮑曼不動桿菌的主要流行菌株型，為醫院感染病原菌的溯源提供技術支持和數據參考。

材料和方法

1 菌株來源 2010年10月1日- 2011年10月1日，每隔2周對外科監護室(20張床)、神經內科監護室(17張床)和呼吸科監護室(18張床)病人周邊環境，包括床扶手、床邊桌、監護儀、病人枕頭以及護士袖口和ICU病房空氣等部位，按《醫療機構消毒技術規范》2012版操作規程進行病原菌采樣。

2 主要儀器與試劑 BioMérieux Vitek Colorimeter比濁儀、水浴搖床、水浴箱、CHEF-Ma pper脈沖電泳儀(Bio-Rad，美國)、Tanon GIS100013凝膠成像儀，SeaKem Gold瓊脂糖凝膠購自美國CambraexBioScience Rockland公司，限制性內切酶ApaI購自Takara公司。

3 菌株培養及藥物敏感性實驗 菌株培養按臨床檢驗操作規程常規方法進行，經法國生物梅里埃Viteck 32鑒定。分離的鮑曼不動桿菌-80℃保存。藥物敏感性實驗采用法國生物梅里埃公司ATB藥敏條，對所收集的菌株對氨芐西林/舒巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環丙沙星、多黏菌素E、復方新諾明的藥物敏感性進行檢測，參照美國實驗室標準化委員會(NCCLS)判斷標準進行判讀。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。根據規范對3類或3類以上抗菌藥物同時呈現耐藥的鮑曼不動桿菌，定義為多重耐藥菌，納入本次研究[3-4]。

4 脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)檢測分子分型 取新鮮菌落，用比濁儀調整菌液溶度至3.6 ～ 4.5(4.0最佳)混勻。取400μl細菌懸濁液包埋后，20μl蛋白酶K(0.5 mg/ml)裂解，TE液洗脫，限制性內切酶ApaI 50 U 37℃水浴中孵育酶切至少4 h，0.5×TBE電泳緩沖液，電泳條件：電壓6 V/cm，夾角120°，脈沖時間5 ～ 30 s，電泳20 h。電泳結束后，EB染色25 ～ 30 min，清水脫色60 ～ 90 min，Tanon GIS100013凝膠成像系統成像。根據PFGE圖譜帶型判斷個體菌株間的相關性，條帶數相同，且相應條帶大小相同時，為同一克隆株；有3條以下(包括3條)條帶差異的菌株，為同一克隆株的不同亞種；菌株出現4 ～ 6條帶差異，為可能相關菌株；有7個或更多個條帶的差異的菌株為不相關菌株。

5 統計方法 利用BioNumerics軟件對菌株電泳結果進行聚類分析。

結 果

1 菌株分布 2010年10月- 2011年10月我院3個監護室病人周邊環境共采集標本7 878份，分離鮑曼不動桿菌229株，其中多重耐藥鮑曼不動桿菌89株，分離率為1.13%(89/7 878)；在多重耐藥鮑曼不動桿菌分離株中，呼吸監護室(RICU)占40.5%(36/89)，外科監護室(SICU)占28.1%(25/89)，神經內科監護室(NICU)占31.5%(28/89)，3個監護室多重耐藥鮑曼不動桿菌污染程度差異無統計學意義(P＞0.05)。選取病人多重耐藥鮑曼不動桿菌分離株4株，其中呼吸監護室3株，神內監護室1株，作為基因型對照(表1)。

2 多重耐藥鮑曼不動桿菌PFGE聚類分析 對93株鮑曼不動桿菌進行PFGE分型，PFGE圖譜條帶為15 ～ 20條。同一ICU鮑曼不動桿菌PFGE圖譜型相似但不完全相同。不同ICU鮑曼不動桿菌PFGE圖譜型差異較大(圖1)。93株鮑曼不動桿菌產生的基因圖譜可分為A、B、C 3大聚類。A聚類分為A1 ～ A9九個亞聚類，在3個監護室均有分布，其中4株病人菌株均是A類，3株呼吸監護室病人菌株分別為A1、A5、A8亞聚類，1株神經內科監護室病人菌株為A8亞聚類。89株環境菌株以A2聚類為主，占24.7%；A1亞類和A8亞類均占15.1%，其中呼吸監護室環境菌株以A1亞類為主，占8.6%；A2亞類占7.5%、A8亞類占4.3%。外科監護室環境菌株以A2聚類為主占7.5%，為A1聚類占5.4%、A8聚類占4.3%；神經內科監護室環境菌株以A2聚類為主占9.7%，A6聚類占5.4%、A8聚類，A9聚類占4.3%。B聚類主要集中于呼吸監護室環境菌株中，占4.3%；C聚類集中在呼吸監護室環境菌株中占2.2%。

3 菌株間同源性分析 在同一監護室中，呼吸監護室同源性90%以上的菌株有3株，分別是病人痰液分離株(20110523h8-6，分離自2011年5月)、枕頭分離株(20101206h11-1，分離自2010年12月)和護士袖口分離株(20101115h13-2，分離自2010年11月)；神內監護室同源性90%以上的菌株2株，分別是病人痰液分離株(20110926s14-6，分離自2011年9月)和枕頭分離株(20110509s13-1，分離自2011年5月)。在不同監護室間，存在同源性90%以上的分離株有3組：分離自外科監護室桌面的菌株(20101206w14-4，分離時間2010年12月)和分離自呼吸監護室枕頭的菌株(20110912h9-1，分離時間2011年9月)；分離自外科監護室枕頭(20101206w5-1，分離時間2010年12月)和分離自呼吸監護室枕頭(20101115h12-1，分離時間2010年11月)的菌株；呼吸監護室病人痰分離株(20101123h11-6，分離自2010年11月)與外科監護室病床枕頭的分離株(20100829w1-1，分離自2010年8月)PFGE圖譜型完全一致，同源性100%。

表1 3個監護室多重鮑曼不動桿菌環境菌株基因多態性分布Tab. 1 Genotype distribution of Acinetobacter baumannii isolated from three ICU (n, %)

圖1 9株鮑曼不動桿菌的PFGE電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram of 9 Acinectobacter baumanii isolates 1： NICU environment 20110912s14-1； 2： RICU human 20101123h11-6； 3： SICU environment 20110912w16-1； 4：RICU environment 20110912h9-5； 5： NICU environment 20110912s12-1； 6： RICU environment 20110912h9-1b； 7：SICU environment 20110829w1-1； 8： RICU environment 20110829h6-4； 9： SICU environment 20111109w15-2

討 論

全球對多重耐藥鮑曼不動桿菌的研究發現，歐洲、北美、阿根廷、巴西、中國大陸、中國臺灣、中國香港、日本、韓國。甚至偏遠的西太平洋大西地島等，均存在多重耐藥鮑曼不動桿菌克隆株的播散，不僅限于病房內、科室內、不同科室間，還可以在整個國家，甚至在不同國家間廣泛傳播[5-7]。但引起大范圍流行與傳播的多重耐藥鮑曼不動桿菌均來源于病人。有關醫院環境中的多重耐藥鮑曼不動桿菌的基因多樣性及與病人分離株的相關性如何，相關報道很少。

本次調查顯示，在我院3個監護室病人周邊環境共采集標本7 878份中，其中多重耐藥鮑曼不動桿菌分離率為1.13%(89/7 878)；3個監護室多重耐藥鮑曼不動桿菌污染程度無統計學差異(P＞0.05)。89株環境和4株鮑曼不動桿菌的基因圖譜總體分散，當相似性系數為40%時，可分為A、B、C 3大聚類。89株環境菌株以A2亞類為主(占24.7%)，其次為A1亞類和A8亞類(各占15.1%)，時間和空間上未見集中趨勢，提示監測期間，采取的每日兩次清潔消毒，污染后隨時清潔消毒的清潔方式下，各監護室沒有形成優勢菌株，造成播散。

在同一監護室中，呼吸監護室同源性90%以上的菌株有3株，護士袖口和枕頭分離株分離時間相隔1個月，但與病人感染時間相隔5個月，病人之前未在我院住過院。神內監護室同源性90%以上的菌株2株，分離時間相隔5個月。在不同監護室間，存在同源性90%以上的分離株有3組，分離自外科監護室桌面的菌株和分離自呼吸監護室枕頭的菌株分離時間間隔9個月；分離自外科監護室枕頭和分離自呼吸監護室枕頭的菌株分離時間間隔1個月；呼吸監護室病人痰分離株與外科監護室病床枕頭的分離株分離時間間隔3個月。本次調查中雖然在相似性較高的菌株間沒有明顯的流行病學關聯，但提示病人枕頭分離株與病人菌株相關性較高，說明易被污染，在日常工作中應注意清潔消毒。

研究顯示，鮑曼不動桿菌主要通過染色體基因突變、外膜孔蛋白改變、藥物主動外排系統(adeABC基因簇編碼的泵出系統[8])和產生滅活酶(如β-內酰胺酶、碳青霉烯酶[9]、鈍化酶[10]等)等共同介導多重耐藥性或泛耐藥性。最近國外學者通過比較抗菌藥物產生前后75余年多種致病菌中質粒種類及其基因結構，發現這些細菌的質粒譜并無明顯變化，只是許多耐藥質粒中出現了多種插入序列，這些可移動的特殊DNA序列(整合子)是介導耐藥基因在質粒之間或質粒與染色體之間轉移、集聚和重組的重要工具，它不僅可通過位點特異性重組系統在細菌中傳播，而且具有高效捕獲耐藥基因的功能[11]。臨床上出現多重耐藥的鮑曼不動桿菌與可移動的整合子對耐藥基因的積累是分不開的。本次研究中的分離的環境多重耐藥菌株耐藥性呈現較高水平，但除了5組(8株)環境菌株相關性較高以外，其余81株基因型呈多樣性，沒有明顯的流行優勢株，其耐藥性的獲得可能與質?；蛘献拥乃絺鞑ビ嘘P，因而合理使用抗生素，盡可能減少篩選出攜帶新型耐藥基因的菌株，才能有效防止多重耐藥菌在醫院內的暴發和環境污染。

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