多菌種共固定化發酵制備枸杞紅棗乳酸飲料

徐 敏，田 輝，杜金城，丁秀云，于上富，霍貴成*

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

枸杞（Lycium chinense）又名“卻老子”，含有大量VA、VB1、VB2及鐵、鈣等多種礦物質元素。紅棗又名大棗，含有豐富的維生素C等，被譽為“天然維生素丸”[1]。NEDOVIC V A等[2]通過共固定酵母菌和明串珠菌后，研究其對蘋果酒的連續發酵的影響，結果表明，該方法可以較好地改善蘋果酒的風味與質量。另外，SCOTT J A等[3]用海綿狀材料將酵母菌與風味菌種共固定，然后用于蘋果酒飲料的生產，結果表明，應用共固定化技術，酒精發酵和蘋果酸-乳酸發酵兩個過程，這兩個發酵過程可以在一個反應器中同時進行，大大簡化了蘋果酒的生產工藝。在國內對細胞共固定化技術的研究始于陳佩華等[4]采用吸附-包埋的方式，將酵母菌、黑曲霉及其產生的糖化酶共同固定在甘蔗渣上，經過增殖培養，直接將淀粉轉化為酒精。本研究期望為枸杞紅棗乳酸飲料產業提供技術依據，為提高水果產業的附加值提供新的動力支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞和鮮大棗：市售；保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌粉：乳品科學教育部重點實驗室。

蛋白胨、牛肉膏：北京奧博星生物技術有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：英國OXOID公司；葡萄糖、瓊脂、磷酸氫二鉀：天津光復科技發展有限公司；硫酸錳、檸檬酸氫二胺、乙酸鈉：天津東麗區天大化學儀器廠；Tween-80：天津光復精細化工研究所；以上試劑均為分析純。

MRS培養基：蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1.1 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二氨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水950 mL；固體培養基添加1.6%的瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

豆漿機：九陽公司；DU800紫外可見分光光度計：美國BECKMAN公司；GL-21M離心機：上海市離心機械研究所；DHP-9272電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；PL2002電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HVE-50全自動高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；XK96-A快速混勻器：姜堰市新康醫療器械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞紅棗乳酸飲料生產工藝流程

1.3.2 工藝要點

枸杞原汁制備：鮮枸杞清洗后，用豆漿機榨汁后用3層紗布過濾后5 000 r/min離心10 min，得澄清枸杞原汁，4 ℃保存備用。

棗汁的制備：將新鮮的大棗清洗后人工去核，用豆漿機榨汁后紗布過濾，以去除大的棗皮，最后5 000 r/min離心20 min，得澄清棗汁，4 ℃冰箱保存備用。

菌種活化及菌落觀察：

（1）菌種的活化

將從-20 ℃冰箱取出的乳酸菌在室溫條件下融化，以2%的接種量接種到5 mL的MRS液體培養基中進行活化，37 ℃培養14 h后，用混勻器將培養液充分混勻，用接種環在培養液中輕沾少許液體，在MRS固體培養基上進行三區劃線，37 ℃培養。

（2）菌體及菌落形態的觀察

菌株在MRS固體培養基上培養24 h后，選取一個較大菌落，挑取其中的1/2菌落，進行革蘭氏染色和油鏡觀察，并照相。

（3）生長曲線的測定

用接種環挑取另外的1/2菌落，接種于MRS液體培養基中，培養約14 h，以2%的接種量接種于MRS液體培養基中，培養約14 h時，再以2%接種量分別接種于54個盛有MRS液體培養基的試管中，并在54個試管分別標上0、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h（共18個時間段，每個時間段3個平行），37 ℃恒溫培養，從起點開始計時當到達上述時間時，將對應的3支試管取出放入4 ℃冰箱中，待18個時間段全部取出后一起用紫外分光光度計測定pH；采用梯度平板稀釋法測定0～30 h內的活菌數，重復3次，作生長曲線。

梯度平板稀釋法：無菌操作，將培養好的菌液搖勻，吸取1 mL加入9 mL無菌生理鹽水中，制成1∶10的稀釋液，再依次進行10倍遞減梯度稀釋，至適當稀釋度，吸取1 mL置于滅菌的培養皿中，倒入約15 mL、50 ℃左右的MRS瓊脂培養基，輕輕搖勻。待培養基凝固后，置于37 ℃恒溫培養箱中倒置培養48 h后進行菌落計數，結果以CFU/mL表示。

將混合菌粉接種于MRS液體培養基內，37 ℃培養24 h，傳代2～3次后，取將對數期后穩定期初的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌菌液離心（5 000×g，4 ℃，10 min）收集菌體，無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate butter saline，PBS）清洗3次，用無菌PBS重懸菌體，制備細胞懸液，并調整菌濃度為108CFU/mL，于4 ℃儲存，備用。

微生物細胞固定化方法：將10 mL（菌數約為108CFU）保加利亞乳桿菌嗜熱鏈球菌細胞懸液，加入一定含量的海藻酸鈉溶液（固定化載體溶液），用渦旋振蕩器混勻5 min，用一次性注射器取20 mL左右的海藻酸鈉溶液，滴進氯化鈣溶液（固定化顆粒），進行造粒，4 ℃條件，固定化20 h左右備用。

發酵原液的調配：取適量的枸杞汁，然后用飽和碳酸鈉溶液調pH，當pH值約為7.0時，對發酵原液進行巴氏消毒，然后室溫條件下冷卻20 min，再按一定的比例加入大棗汁，以此，制備發酵原液[5-7]。

1.3.3 測定方法

固定化載體機械強度的測定方法：在固定化載體的正面，用50 g砝碼按壓，以其能承受的最大壓力來表示固定化載體的機械強度；固定化載體的機械強度計算公式[8]：

式中：d為施壓前后固定化載體的直徑差，mm；50為砝碼質量，g；R為施壓前固定化載體的半徑，mm；r1、r2、r3為施壓后固定化載體的半高度，mm；π為圓周率3.14；Pi為固定化載體的機械強度，g/mm2；P為平均固定化載體的機械強度，g/mm2。

還原糖及乳酸測定方法：還原糖的含量測定采用DNS法；乳酸的含量測定采用酸堿滴定法[9]。

感官評價指標：隨機選取50名性別不同、年齡各異、語言表達能力強的人員進行感官評價，每組20人均進行評分，排除偏差，試驗結果取平均值，然后進行分析，枸杞紅棗乳酸飲料的感官評分標準如表1（滿分100分）。

表1 枸杞紅棗乳酸飲料的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of Lycium chinense and date yoghourt drink

2 結果與分析

2.1 枸杞汁、大棗汁比例對發酵的影響

枸杞汁、大棗汁的比例一定程度上影響著乳酸菌的發酵效果，以枸杞汁與大棗汁體積比1∶6、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1的比例[10-12]，接種量為10%的混合菌株，37 ℃發酵26 h進行試驗，以感官評價為標準，篩選出兩種果汁最佳配比，結果見表2。

表2 發酵原液配比對發酵的影響Table 2 Effect of fermentation broth ratio on fermentation

由表2可知，隨著枸杞汁所占比例的增大，組織狀態逐漸變差、酸味逐漸變弱；枸杞汁與大棗汁的體積比為1∶2時能達到較好的產酸效果又不會出現嚴重分層現象；所以選擇枸杞汁和大棗汁的比例為1∶2進行后續試驗。

2.2 海藻酸鈉和氯化鈣對固定化顆粒特性的影響

氯化鈣和海藻酸鈉是影響固定化載體特性的主要因素；故選取氯化鈣濃度和海藻酸鈉質量分數的不同比例，以機械強度為評價指標進行試驗，從而選出適宜的兩者比例用于制備紅棗枸杞乳酸飲料。參考相關文獻[13]，本試驗設置了4個氯化鈣濃度：0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L和4個海藻酸鈉質量分數：4%、5%、6%、7%；試驗結果見表3。

表3 海藻酸鈉含量和氯化鈣濃度對固定化顆粒特性的影響Table 3 Effect of calcium chloride and sodium alginate concentration on immobilized yeast characteristics

由表3可知，隨著氯化鈣含量的減小，固定化顆粒的機械強度呈現增大的趨勢；而同時，隨著海藻酸鈉含量的減小，整體上，固定化顆粒的機械強度的趨勢為減小趨勢；氯化鈣濃度與機械強度呈負相關，而海藻酸鈉含量與機械強度之間呈正相關。當氯化鈣濃度為0.05 mol/L，海藻酸鈉含量為7%時，固定化顆粒的機械強度可達23.11 g/mm2；因此13號處理為最優組合，即氯化鈣濃度為0.05 mol/L，海藻酸鈉含量為7%，選擇此組合進行后續試驗。

2.3 接種量對產品品質的影響

在上述最優條件獲得的基礎上，參考相關文獻[14-15]，關于乳酸菌的接種量，分別選取2%、6%、10%、14%、18%五個梯度，37 ℃發酵26 h；以乳酸飲料組織狀態、口感為指標，篩選出混合菌株最佳接種量，結果見表4。

表4 混合菌株接種量對產品組織狀態的影響Table 4 Effect of mixed strains inoculum on organization status of product

由表4可知，隨著接種量的增加，組織狀態越差，容易分層，而酸味隨著接種量的增加而增加；綜合考慮，選取混合菌株的接種量為10%。

2.4 發酵時間對產品品質的影響

在上述最優條件的基礎上，參考相關文獻[16]，在接種量為10%，37 ℃條件下分別發酵15 h、25 h、35 h、45 h，以乳酸飲料色澤、口感為評價指標，篩選出混合菌株最佳發酵時間，結果見表5。

表5 發酵時間對產品品質的影響Table5 Effect of fermentation time on product quality

從表5可以看出，隨著發酵時間的延長，乳酸飲料的顏色越深；然而，隨著發酵時間的延長，乳酸飲料的酸味越重；當浸提時間為35 h時，飲料的色澤和口感較佳，故選擇的發酵時間為35 h。

2.5 蔗糖添加量的確定

參考本研究預試驗的結果及相關參考文獻，選取蔗糖添加量4%、6%、8%、10%4個添加梯度[17]，按照工藝流程圖與枸杞紅棗果汁混合物混合，斡旋振蕩器振蕩10 min，然后加入嗜熱鏈球菌保加利亞乳桿菌進行發酵，以感官評價得分為評價指標，確定制備枸杞紅棗乳酸飲料蔗糖的最佳添加量。

表6 蔗糖添加量對乳酸飲料品質的影響Table 6 Effect of sucrose addition on product quality

由表6看出，隨著蔗糖添加量的變大，組織狀態越來越有厚重感，而味道越來越甜；當添加量為8%時，產品的組織狀態與風味均達到了較好的狀態，綜合各方面的因素考慮，初定確定蔗糖添加量為8%。

2.6 正交試驗

根據上述試驗結果，本研究初步認為影響枸杞紅棗乳酸飲料品質的主要因素為保加利亞乳桿菌嗜熱鏈球菌混合菌接種量、蔗糖添加量和發酵時間，所以以接種量、蔗糖添加量和發酵時間為3個試驗因素，每個因素選取3個水平，進行正交試驗，其因素與水平見表7。

表7 枸杞紅棗乳酸飲料發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 7 Factors and levels of orthogonal experiment for Lycium chinense and date drink fermentation conditions optimization

表8 枸杞紅棗乳酸飲料發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiment for Lycium chinense and date drink fermentation conditions optimization

由表8可知，影響品質的重要因素為接種量，其次為蔗糖添加量；從9個處理可以直觀的看出，最好的組合是A2B2C3，即接種量為10%，發酵時間為35 h，蔗糖添加量為9%。在此最佳條件下，感官評分為92分。

3 結論

研究結果表明，當枸杞汁、紅棗汁的體積比為1∶2，氯化鈣物質的量濃度為0.05 mol/L，海藻酸鈉質量分數為7%，接種量為10%，發酵時間為35 h，蔗糖添加量為9%，添加適量甜味劑、乳酸鈣等輔料時，枸杞紅棗乳酸飲料產品品質良好，發酵速度適宜。

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