超聲波輔助萃取-氣相色譜法測定青椒中有機磷農藥殘留的研究

顏 琪

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

青椒營養價值高，富含VB、VC、胡蘿卜素等，尤其是VC的含量是番茄的7～15倍，具有促進消化、預防癌癥等功效[1]。有機磷農藥是繼有機氯農藥以后被廣泛使用的一類高效、廣譜的化學殺蟲劑，因其易降解、價格低廉等特點[2]在農業生產中得到了廣泛的應用。目前生產使用的多為高效低毒低殘留的品種（如敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷等[3]）。

雖然農藥的施用可以有效提高蔬菜制品的質量品質，但是蔬菜中農藥殘留超標會對人體造成急、慢性中毒，引起神經紊亂、精神失常等病癥，導致癌癥、畸形、突變等危害[4]。蔬菜的安全問題尤其是農藥殘留問題已經引起了各國政府的高度重視和社會公眾的廣泛重視。旨在保障公眾身體健康和生命安全的《中華人民共和國食品安全法》中，農產品的農藥殘留檢測項目日益增多、限量要求日益嚴格[5-6]。因此，對蔬菜中農藥殘留進行檢測，是食品衛生與安全監督的重要環節，也是高效、合理使用農藥的技術保障，對降低蔬菜中農藥殘留、中毒事件的發生，保障人民身體健康具有重要意義。

目前，有機磷類農藥檢測方法有光譜法、試紙法技術、色譜法、免疫學方法、生物傳感器與生物芯片技術[7-9]。由于有機磷農藥大部分具有較好的揮發性，且氣相色譜法的檢測器靈敏度高，是對有機磷類農藥最有效的分離手段[10]。本研究采用超聲波輔助萃取-氣相色譜法，旨在建立安全有效萃取青椒中5種有機磷農藥的技術方法，通過響應面試驗優化有機磷農藥溶劑萃取條件，得到最優的技術參數，達到有效提高農藥提取率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機抽取市售青椒50份。

農藥標準品：（1）標準溶液儲備液：敵敵畏（dichlorvos）、甲胺磷（methamidophos）、乙酰甲胺磷（acephate）、氧樂果（omethoate）、倍硫磷（fenthion），質量濃度為100 μg/mL；（2）混合標準溶液：分別取有機磷類農藥標準溶液儲備液，以丙酮定容，配制成質量濃度為5.00 mg/kg的混合標準溶液，再逐漸稀釋成0.50 mg/kg、0.05 mg/kg。

丙酮（色譜純，經重蒸）、乙腈（色譜純）、氯化鈉（分析純，140 ℃烘烤4 h）：天津市光復科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6890氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；XH-B漩渦混合器：姜堰市康健醫療器具有限公司；N-EVAP氮吹儀：美國Organomation公司；H09-T25勻漿機：德國IKA集團；ME梅特勒分析天平：武漢宏錦科技有限公司；0.2 μm微孔濾膜：天津富集科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

將抽取的青椒樣品取可食部分，切碎，充分混勻，以四分法取樣，放入5.00 mg/kg有機磷混合標準農藥中浸泡15 min，陰暗處放置24 h備用。

1.3.2 有機磷農藥檢測方法

（1）有機磷農藥的測定方法

參考NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》[11]的方法并予以改進：準確稱取25.0 g青椒試樣，加入一定體積的乙腈，在勻漿機中高速勻漿2 min后，超聲提取一定時間，通過濾紙過濾至裝有5～7 g氯化鈉[12]的100 mL具塞量筒中，渦旋振蕩1 min，室溫條件下靜置30 min使其分層。從具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈，一定水浴溫度條件下氮吹蒸發至近干，最后用丙酮定容至2.0 mL，0.2 μm濾膜過濾。以保留時間定性，峰面積外標法定量，在相同色譜條件下，分別將標準溶液及樣品溶液經氣相色譜分析。

（2）氣相色譜測定條件

色譜柱：聚苯基甲基硅氧烷（DB-17）色譜柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）；進樣口溫度：220 ℃；進樣方式：不分流進樣；檢測器：火焰光度檢測器（溫度為250 ℃）；柱溫：150 ℃保持2 min，以8 ℃/min的速度升至250 ℃保持12 min；載氣：氮氣流速為10 mL/min；進樣量1.0 μL。

（3）回收率的計算

式中：X為試樣中實測有機磷農藥的含量，mg/kg；A為試樣所含有機磷農藥的含量，mg/kg；B為加入標品量，mg/kg。

1.3.3 有機磷農藥溶劑萃取條件的優化

表1 萃取條件優化響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment for extraction condition optimization

在單因素試驗基礎上，選定超聲時間、料液比和水浴溫度對有機磷農藥萃取效果影響顯著的3個因素進行優化，根據中心旋轉組合設計和數據處理，確定最佳萃取條件。選取超聲時間（A）、料液比（B）、水浴溫度（C）為試驗因子，以有機磷農藥的回收率Y為響應值，試驗因素與編碼水平設計見表1。

2 結果與分析

2.1 樣品的預處理

樣品預處理過程中采用勻漿、過濾和振蕩的方法，通過這些方法可以增加農藥殘留量的提取率。有機磷類農藥的測定中，用乙腈與丙酮作為農藥提取劑及分配凈化劑[13]。李四生等[14]認為提取中采用鹽析作用有利于兩相分層，提高有機磷農藥在有機相中的分配系數，從而提高萃取率。故本試驗采用加入過量的氯化鈉，更加有利于乙腈從水相中分離出來，從而提高有機磷農藥在乙腈中的濃度。用氮吹儀代替旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮效率高，農藥損失率低，溶劑處理量小[15]。

2.2 色譜條件

色譜柱類型、柱溫度、載氣流速是影響氣相色譜分離效果、分析時間長短和方法靈敏度的主要因素[16]。本試驗農藥殘留的檢測中，如果選用恒溫，則農藥出峰時間長，峰形差，不能得到有效分離。因此采取程序升溫，能兼顧高、低沸點組分的分離效果和分析時間，使不同沸點的組分基本上都能在其較合適的柱溫條件下進行分離。色譜柱選擇聚硅氧烷類，其極性范圍廣（從弱極性到強極性），選擇性強，能滿足多種有機磷農藥殘留的分析測定[17-18]。

2.3 檢測方法可靠性分析

2.3.1 有機磷農藥檢測方法

圖1 5種有機磷農藥標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solutions of five organophosphorous pesticides

按上述氣相色譜條件分析測定，5種有機磷農藥混合標準樣品色譜圖見圖1，可以看出，敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、倍硫磷在其保留時間（分別為2.249 min、2.784 min、4.533 min、5.310 min、5.717 min）處都具有明顯而尖銳的峰，峰形對稱，基線平穩，5種農藥在6 min內可獲得良好分離。其中的雜峰基本上對標樣的組分沒干擾，分離效果好。說明采用的檢測條件合適，方法可行。

2.3.2 方法的精密度、準確度及靈敏度

測定方法的準確度、精密度和靈敏度分別以全過程的加標回收率、相對標準偏差（relative standard deriation，RSD）及檢出限衡量。按1.3.2檢測方法，在25.0 g青椒試樣中分別添加質量濃度為0.05 mg/kg、0.50 mg/kg、5.00 mg/kg的5種有機磷農藥混合標準溶液1 mL進行加標回收率試驗，測出回收率并計算相對標準偏差。加標回收率、相對標準偏差及檢出限結果見表2。

表2 5種有機磷農藥的檢出限、加標回收率與相對標準偏差Table 2 Limit of detection,recovery rates and RSD of five organophosphorous pesticides

由表2可以看出，5種有機磷農藥的平均回收率為78.6%～93.6%，RSD≤5.2%，檢出限范圍為0.008～0.015 mg/kg，方法的回收率較高，相對標準偏差較低，檢出限符合對農產品中農藥殘留檢測的要求[19]。說明該方法具有良好的準確度、精密度和靈敏度。采用本試驗的檢測方法檢測這5種農藥在青椒中的殘留量是可行的，均可達到定量分析的要求，方法準確可靠。

2.4 響應面法優化有機磷農藥的溶劑萃取條件

2.4.1 回歸方程及方差分析

以有機磷農藥的回收率作為響應值，對超聲時間（A）、料液比（B）、水浴溫度（C）進行3因素3水平響應面中心組合試驗設計，結果見表3，方差分析見表4，模型可信度分析見表5。

由表3、表4所得的多項式回歸模型為：Y=-241.74+10.31A-21.64B+7.46C-0.11AB-0.087AC+0.45BC-0.13A2-3.78B2-0.045C2。該模型在α=0.01的水平上高度顯著，失擬項不顯著（P＞0.05）。根據回歸方程各個系數絕對值的大小可判斷3個因素對有機磷農藥的回收率的影響順序為料液比＞超聲時間＞水浴溫度。

表3 萃取條件優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiment for extraction condition optimization

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

表5 模型可信度分析Table 5 Reliability analysis for model

由表5可知，復相關系數R2=0.910 3，表明有機磷農藥回收率響應值的0.910 3是由所選變量超聲時間、料液比、水浴溫度引起，回收率的實際值與理論預測值之間具有較好的擬合相關性。變異系數（coefficient of variation，CV）越低，試驗的可信度和精確度越高，CV值等于3.72%，表示該試驗的可信度和精確度較高。綜上所述，所得回歸方程為有機磷農藥溶劑萃取條件的優化提供了合適的模型，可代替真實試驗點對農藥回收率進行預測。

2.4.2 響應面分析及最優萃取條件的確定

對超聲時間、料液比及水浴溫度3個因素，進行兩兩交互作用分析，得到響應面圖（反映各個試驗因素對響應值的影響程度）和等高線圖（反映最佳條件下各個試驗因素的值）。從圖2可以看出，超聲時間和水浴溫度、料液比和水浴溫度的交互作用顯著，超聲時間和料液比交互作用不顯著。

圖2 超聲時間、料液比與水浴溫度交互作用對回收率影響的響應面及等高線圖Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasonic time,solid-liquid ratio and water bath temperature on recovery rate

對所得的回歸模型進行數學分析，得出有機磷農藥的最佳萃取條件為超聲時間13.4 min、料液比1∶1.5（g∶mL）、水浴溫度76.7 ℃。在此最優萃取條件下，有機磷農藥的回收率理論值為97.05%。

2.4.3 驗證試驗

為了進一步驗證響應面分析法的可靠性，采用上述最優條件萃取有機磷農藥，實際測得到的回收率為96.82%，與理論值相比，誤差為0.23個百分點。因此，該模型合理有效，采用響應面分析優化得到的最優萃取條件參數真實可靠，可用于實際操作。

3 結論

本研究采用超聲波輔助萃取-氣相色譜法，旨在建立安全有效地萃取青椒中5種有機磷農藥的技術方法，通過響應面試驗優化有機磷農藥溶劑萃取條件，得到最優的技術參數，各因素對回收率的影響次序是：料液比＞超聲時間＞水浴溫度；通過中心組合設計及響應面分析獲得的最佳工藝參數為超聲時間13.4 min、料液比1∶1.5（g∶mL）、水浴溫度76.7 ℃，理論回收率為97.05%，實測值為96.82%。該方法相對標準偏差是2.1%～5.2%，檢出限的范圍是0.008～0.015 mg/kg。所得的優選方法為有機磷農藥溶劑萃取條件提供了擬合度很高的模型，更準確地代替真實試驗點對回收率進行預測，具有一定的實際應用性。與傳統方法相比，該法操作簡便，提高了分析效率及檢測靈敏度，適用于大批量檢驗工作，進一步為有機磷農藥的檢測研究提供一定基礎，對確保公眾食用安全放心的青椒具有重要的現實意義。建立的5種有機磷農藥殘留的檢測方法可行，適于推廣。

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