復合酶輔助熱水浸提法提取榆樹皮多糖工藝研究

魏 征，馬韻升，劉圣鵬，虞鳳慧，王杉杉

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博控股股份有限公司，山東 濱州 256500）

榆樹（Ulmus pumilaL.）在我國自然分布較廣，且耐寒、耐旱、耐貧瘠。榆樹根系發達，抗風保土能力極強，可以在較為干旱的貧瘠荒丘上生長，資源豐富。榆樹皮又稱榆白皮，主要有利水、通淋、消腫等功能[1]。其皮中富含各種有機物質，如多糖類、膠質、木質素等[2]?，F確定植物多糖的主要功能有調節免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血糖等作用[3]。榆樹皮多糖具有很強的還原能力，對羥自由基和超氧自由基在一定程度上有抑制和清除作用[4]，可以作為天然抗氧化劑。

隨著人們對多糖食用、藥用價值重視程度的提高，目前多糖的實驗室提取方法已經比較成熟，主要有水提法、堿液提取法、溶劑提取法、超聲波萃取法、微波法、酶法等[5]。近年來，超濾膜技術和超臨界萃取技術也逐漸應用于多糖提取領域[6]。傳統方法中多糖的提取采用回流法[7-8]，該方法提取率低，極易導致多糖的降解，影響其活性。酶技術的提取條件溫和，破壞細胞壁能力強，可以水解植物中的膠質，能充分釋放細胞里的活性成分，已被廣泛應用于植物中有效成分的提取[9-13]。本試驗采用復合酶輔助熱水浸提法對榆樹皮多糖提取工藝進行研究，在單因素試驗的基礎上，采用正交設計對榆樹皮多糖的提取時間、提取溫度、料液比進行優化，旨在獲得一種得率高、品質好的榆樹皮多糖提取條件，從而為榆樹皮多糖的工業生產、開發應用提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榆樹皮：山東博華農業有限公司；纖維素酶（20000U/g）：實驗室自制；果膠酶（200 000 U/g）：蘇柯漢濰坊生物工程有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）、苯酚（分析純）、硫酸（分析純）：萊陽經濟技術開發區精細化工廠。

1.2 儀器與設備

FA-2004型分析天平：上海上平儀器有限公司；HH-1型數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市融化儀器制造有限公司；JJ-1型精密增力電動攪拌器：上海浦東物理光學儀器銷售部；DL-6M大型低速離心機：長沙湘儀離心機科技有限公司；RE-2000B型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；752N型紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機：北京博醫康有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榆樹皮多糖提取工藝流程

榆樹皮粉末→乙醇脫脂→復合酶浸提→熱水浸提→離心→Sevage法除蛋白→濃縮→冷凍干燥→榆樹皮多糖粗品

1.3.2 榆樹皮多糖提取操作要點

緩沖溶液的配制：分別配制0.1 mol/L的檸檬酸及檸檬酸鈉溶液，并按比例配成pH 4.6的緩沖溶液。

復合酶液配制：稱取等質量的纖維素酶和果膠酶，加入10倍體積的緩沖溶液，40 ℃水浴活化20 min。

精確稱取粉碎的榆樹皮粉末10 g，加入15倍體積分數為80%乙醇，于80 ℃水浴脫脂1 h，冷卻、離心、收集濾餅備用。將濾餅按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，向榆樹皮水溶液中加入0.2%的復合酶（纖維素酶/果膠酶為1∶1），在45 ℃條件下浸提1 h，100 ℃滅酶10 min，冷卻，在4 000 r/min條件下離心，收集濾餅，加入蒸餾水，在水浴鍋中浸提一定時間后，離心，合并2次上清液，Sevage法除蛋白，減壓濃縮至原體積的1/5，冷凍干燥得到榆樹皮多糖粗品。

1.3.3 葡萄糖標準曲線的繪制[14-17]

葡萄糖標準溶液的配制：準確稱取在105 ℃干燥至質量恒定的葡萄糖標準品0.100 0 g，置于50 mL燒杯中加蒸餾水溶解，并全部轉移至100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，另取10 mL該溶液于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，配成質量濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液。

葡萄糖標準曲線的繪制：精密吸取0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL（相當于葡萄糖含量0、0.02 mg、0.04 mg、0.06 mg、0.08 mg、0.10 mg、0.12 mg），分別置于25 mL比色管中，準確補充蒸餾水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸5.0 mL，在旋轉均勻器上小心混勻，冷卻后，用分光光度計在波長490 nm處測其吸光度值，以試劑空白溶液為參比，制得標準曲線。

1.3.4 樣品中多糖含量測定

取干燥榆樹皮粗多糖供試品，將其稀釋至合適倍數，精確吸取待測液2 mL置于25 mL比色管，按照葡萄糖標準曲線繪制方法，用分光光度計在波長490 nm處測定其吸光度值。從葡萄糖標準曲線回歸方程計算葡萄糖的質量，計算樣品中多糖含量。多糖含量的計算公式如下：

式中：C為供試液中葡萄糖的質量濃度，μg/mL；D為樣品液的稀釋因素；F為換算因子；m為樣品的質量，g。

1.3.5 多糖得率的計算

榆樹皮多糖的得率計算公式如下：

式中：Y為榆樹皮多糖得率，%；m1為榆樹皮粗多糖質量，g；m0為榆樹皮樣品質量，g。

1.3.6 單因素試驗設計

固定工藝中酶解條件（濾餅按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，向榆樹皮水溶液中加入0.2%的復合酶（纖維素酶/果膠酶為1∶1），在45 ℃，pH 4.6條件下浸提1 h，100 ℃滅酶10 min），分別設定提取溫度為55℃、65℃、75 ℃、85 ℃、95 ℃，在料液比1∶20、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90（g∶mL）條件下分別提取1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，100 ℃滅酶10 min，冷卻，過濾，Sevage法除蛋白后，濃縮至原體積的1/5，冷凍干燥，制得粗多糖。計算榆樹皮多糖得率，分別考察提取溫度、時間、料液比對榆樹皮多糖得率的影響。

1.3.7 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選取提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）為3個對榆樹皮多糖得率有影響的因素，進行正交試驗，以榆樹皮多糖得率為評價指標，最終確定榆樹皮多糖提取的最優工藝條件。正交試驗設計因素與水平見表1。

表1 榆樹皮多糖提取條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for elm bark polysaccharide extraction conditions optimization

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的建立

采用硫酸-苯酚法測定不同質量的葡萄糖在波長490 nm處的吸光度值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制出葡萄糖標準曲線，結果如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，在葡萄糖含量0～0.12 mg范圍內，標準曲線線性回歸方程為y=8.002 1x-0.015 5，擬合系數R2=0.998 1，表明葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關系。

2.2 各單因素對榆樹皮多糖提取效果的影響

2.2.1 提取溫度對榆樹皮多糖提取效果的影響

不同提取溫度條件下的榆樹皮多糖得率如圖2所示。

圖2 溫度對榆樹皮多糖得率的影響Fig.2 Effect of temperature on elm bark polysaccharide yield

由圖1可知，不同的提取溫度對多糖得率有明顯的影響。結果表明，浸提溫度在55～75 ℃的范圍內，多糖得率隨著提取溫度的升高而增加；提取溫度＞75 ℃，繼續提高提取溫度，得率反而降低，可能是隨著提取溫度的升高，糖苷鍵容易斷裂，多糖分解，從而影響多糖得率。因此，選擇提取溫度為75 ℃最佳。

2.2.2 提取時間對榆樹皮多糖提取效果的影響

不同提取時間條件下的榆樹皮多糖得率如圖3所示。

圖3 提取時間對榆樹皮多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on elm bark polysaccharide yield

由圖3可知，多糖得率隨著提取時間的延長而增加，原因是時間的延長有利于多糖的溶出，增加了多糖在溶劑中的溶解度。當提取時間達到2.5 h時，多糖得率達到12.6%，此后繼續增加提取時間，多糖得率得變化趨勢較平緩，表明多糖浸出已基本完成。因此，選擇2.5 h作為提取時間較適宜。

2.2.3 料液比對榆樹皮多糖提取效果的影響

不同料液比條件下的榆樹皮多糖得率如圖4所示。

由圖4可知，料液比在1∶20～1∶70（g∶mL）的范圍內，多糖得率隨著料液比的增加而增加；料液比＞1∶70（g∶mL）后，繼續增大料液比多糖得率反而降低，可能是因為料液比的增加有利于雜質等非糖成分的溶出，考慮到料液比過大也會增加后期濃縮分離的能源消耗，因此選擇料液比1∶70（g∶mL）最佳。

圖4 料液比對榆樹皮多糖得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on elm bark polysaccharide yield

2.3 提取榆樹皮多糖的工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對提取時間、提取溫度、料液比進行正交試驗，試驗設計及分析結果見表2，方差分析見表3。

表2 榆樹皮多糖提取條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for elm bark polysaccharide extraction conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，根據極差R的大小，可以判斷各因素對試驗指標的影響主次?？梢娪绊懹軜淦ざ嗵堑寐实囊蛩刂鞔雾樞驗锽＞A＞C，即提取時間＞提取溫度＞料液比。榆樹皮多糖提取的最優方案為A1B3C2，即提取溫度70 ℃，提取時間3.0 h，料液比1∶70（g∶mL）。在此最優提取條件下進行驗證試驗，榆樹皮多糖得率達到13.143%，高于正交試驗表中最大得率12.869%，故可以認為該組合為復合酶輔助熱水浸提法提取榆樹皮多糖的最佳提取工藝。

由表3方差分析可知，提取時間、提取溫度、料液比對榆樹皮多糖的得率均無顯著影響。

2.4 對比試驗

為了考察復合酶輔助熱水浸提法提取榆樹皮多糖的得率，在提取時間、提取溫度、料液比相同的條件下，與傳統的熱水浸提法進行了對比試驗，結果如表4所示。

表4 兩種榆樹皮多糖提取方法的比較Table 4 Comparison of two extraction methods of elm bark polysaccharide

由表4可知，與傳統熱水浸提法相比，復合酶輔助熱水浸提法提取榆樹皮多糖得率提高超過3個百分點，說明復合酶輔助熱水浸提法能有效促進榆樹皮多糖的提取。

3 結論

本研究采用復合酶輔助熱水浸提法提取榆樹皮多糖。通過單因素及正交試驗，以榆樹皮多糖得率為評價指標進行優化，得到最優提取條件為提取溫度70 ℃，提取時間3.0 h，料液比1∶70（g∶mL），復合酶添加量0.2%。并在此最優提取條件下進行驗證試驗，榆樹皮多糖得率達到13.143%，比傳統的熱水浸提法提高超過3個百分點。

熱水浸提法工藝比較簡單，易于操作，但是提取效率低，酶法則利用纖維素酶、果膠酶去分解植物細胞壁及細胞膜的成分，對組織細胞造成破壞，從而促進胞內有效成分的溶出，利用復合酶輔助熱水浸提法提取榆樹皮多糖，具有提取率高等優點，可為大規模工業化生產榆樹皮多糖提供理論依據。

[1]江蘇新醫學院.中藥大辭典（下冊）[M].第一版.上海：上海人民出版社，1977.

[2]王文章，張 文，周 強，等.榆樹皮提取液徐凝作用的實驗研究[J].環境科技，2011，24（5）：26-28.

[3]高春燕，田呈瑞.枸杞多糖體外抗氧化特性研究[J].糧食與油脂，2005，23（7）：28-29.

[4]楊明非.榆樹皮粗多糖組成及體外抗氧化作用[J].東北林業大學學報，2011，39（9）：121-125.

[5]王華芳，吉仙枝.枸杞子多糖提取工藝研究進展[J].安徽農學通報，2014，20（8）：166-168.

[6]張 嬌.枸杞中水溶性多糖的提取工藝研究[D].天津：天津大學碩士論文，2012.

[7]孟憲軍，李東南，汪艷群，等.響應曲面法優化五味子多糖的提取工藝[J].食品科學，2010，31（4）：111-115.

[8]郭志欣，顧地周，宋宇輝，等.五味子藥渣中多糖提取工藝研究[J].江蘇農業科學，2013，41（5）：254-255.

[9]ZHANG J,JIA S Y,LIU Y,et al.Optimization of enzyme-assisted extraction of theLycium barbarumpolysaccharides using response surface methodology[J].Carbohyd Polym,2011,86(2):1089-1092.

[10]YOU Q H,YIN X L,ZHAO Y P,et al.Enzyme assisted extraction of polysaccharides from the fruit ofCornus officinalis[J].Carbohyd Polym,2013,98(1):607-610.

[11]董麗輝，范三輝，凌慶枝，等.酶法提取亮菌多糖的研究[J].中國釀造，2012，31（4）：51-54.

[12]范三紅，李 靜，王亞云，等.超聲波輔助復合酶提取菊糖工藝優化[J].食品科學，2015，36（4）：23-28.

[13]張圣燕.超聲波輔助酶解法提取桔皮中果膠的工藝研究[J].廣東化工，2011，33（11）：27-28.

[14]鄔衛東，張曉文.硫酸-苯酚法測定枸杞膠囊中多糖的含量[J].內蒙古中醫藥，2003（3）：38-40.

[15]劉秀河，吳 燕，艾連中.山藥水溶性多糖提取工藝的研究[J].食品與機械，2007，22（2）：21-23.

[16]梁 華，李雪林，陸亞春.猴頭菇多糖提取工藝研究[J].食品與機械，2007，22（1）：35-37.

[17]何新益，劉仲華.苦瓜多糖的改良苯酚-硫酸法測定和提取工藝[J].食品與機械，2007，23（4）：72-75.