白酒中甜味劑的檢測及其來源的探討

孫 棣，馮永渝，梁桂娟

（貴州省產品質量檢驗檢測院，貴州 貴陽 550004）

我國白酒有幾千年的歷史，在酒類產品中，白酒行業所創造的效益一直名列前茅，并帶動了相關產業的發展。通過監測發現，白酒中甜味劑的使用不是偶然情況，在白酒中加入甜味劑以增加白酒的甜味和回甜感，改善口感已成為白酒行業的潛規則。目前，廣泛應用的人工合成甜味劑主要包括甜蜜素、阿斯巴甜、糖精鈉、安賽蜜等，甜味劑是人工合成的非發酵物質，各香型白酒國家標準中規定不得添加甜味劑[1-5]。

目前食品中檢測甜味劑的方法主要有氣相色譜法（gas chromatographic，GC）[6-8]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-13]、高效液相色譜-質譜聯用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[14-16]等。國標中甜味劑的檢測方法主要是氣相色譜法和高效液相色譜法，但這些方法檢測限高，且國家標準GB/T 5009.97—2003《食品中環己基氨基磺酸鈉的測定》甜蜜素的檢測方法因易出現假陽性結果已被衛生部監督司列入不適合白酒檢測范圍。在實際監測工作中發現，微量甚至痕量的甜味劑即可改善白酒的口感，而傳統的色譜法并不能有效地對白酒中的微量甜味劑進行監控。

為了找到對白酒中幾種甜味劑的檢出限和適宜的本底值，明確判定準則，分清產品因素、人為因素和環境因素所帶來的影響，本研究建立了快速、靈敏、準確的同時檢測白酒中4種甜味劑的高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測方法，并進行了大量白酒樣品中甜味劑的檢測，對白酒生產過程中的甜味劑產生的可能原因進行了分析，為食品安全監管工作提供技術支持，保障白酒的食品安全和質量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原酒、成品酒、曲藥、香料：生產企業庫房抽取；安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、三氯蔗糖標準品（純度均＞98.5%）：德國Dr.Ehrensforfer GmbH公司；甲醇（色譜純）、乙酸銨（色譜純）：德國Merck公司；0.22 μm微孔濾膜：上海信步科技有限公司。

1.2 儀器與設備

4000QTRAP三重四極桿質譜儀：美國AB Sciex公司；Agillent1260高效液相色譜儀：美國Agillent公司；N60M氮氣發生器：美國PEAK公司；UVS-1振蕩混勻器：德國Heielolph公司；Milli-Q Academic超純水系統：密理博（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品儲備溶液和使用溶液的配制

精確稱取安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、三氯蔗糖標準品0.100 0 g，用超純水溶解后定容至100 mL容量瓶中，制備成質量濃度為1 mg/mL的混合標準儲備液，4 ℃保存。

將上述混合標準儲備液逐級稀釋，用超純水配制質量濃度分別為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的混合標準使用溶液。

1.3.2 樣品前處理

酒樣（液體樣品）：取2.0 g樣品，置于25 mL比色管中，加入20 mL蒸餾水渦旋混勻后，用水定容至刻度，混勻后過0.22 μm微孔濾膜待測。

曲藥、香料（固體樣品）：取2.0 g樣品，置于25 mL比色管中，加入20 mL蒸餾水渦旋混勻后超聲提取30 min，取出放至室溫后用水定容至刻度，混勻后濾紙過濾，將濾液過0.22 μm微孔濾膜后進樣測定。

1.3.3 儀器條件

質譜條件：電噴霧（electronic spray ion，ESI）離子源；采用負離子模式；離子監測采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；電噴霧電壓（spray voltage，SV）5 500 V，噴霧氣（GS1）、輔助氣（GS2）、氣簾氣（CUR）流速分別為60 L/h、60 L/h、35 L/h。噴霧氣溫度為650 ℃。定性、定量離子對、錐孔電壓、碰撞電壓等參數見表1。

表1 MRM監測模式的優化條件Table 1 The optimum conditions of MRM mode

高效液相色譜條件：色譜柱Agillent EC-C18（3.0 mm×50 mm，2.7 μm）；流動相為0.01 mol/L乙酸銨水溶液/甲醇；梯度洗脫，具體條件見表2；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

表2 流動相梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions of mobile phase

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的確定

參照行業標準SN/T 1948—2007《進出口食品中環己基氨基磺酸鈉的測定》中前處理方法，取酒樣直接進樣，發現回收率只有30%左右，這可能是因為酒樣中含有酒精等物質產生的基質效應，從而引起回收率偏低。考慮到白酒樣品本身的基質效應，取酒樣在水浴鍋上揮干，用純水定容進樣，發現回收率達到90%以上，也證實了酒樣的基質效應，但該法在揮干酒精的過程中耗時較長，步驟繁瑣，后來對方法進行了改進，通過直接用超純水稀釋10倍后進樣，發現該方法回收率為95%左右，大大降低了白酒的基質效應、方法簡便快速。

對于曲藥，香料等固體物質采用超聲法將水溶性甜味劑提取到水溶液中，通過過濾凈化后進樣，方法簡便，回收率＞90%，適用于固體樣品中甜味劑的前處理。

2.2 色譜條件的選擇

從不同流動相對待測物質在色譜柱上的分離度、峰形、靈敏度和保留時間等的影響為考察指標，對水-甲醇體系和乙酸銨-甲醇體系進行了比較，結果發現，乙酸銨-甲醇體系分離4種甜味劑時分離度、峰形、靈敏度以及保留時間的穩定性均優于水-甲醇體系。這是由于乙酸銨是緩沖溶液，可提高待測物質的離子化效率，同時又可作為離子對試劑提高待測物質在反相色譜柱上的保留時間，從而改善其在液相色譜中的保留行為[17]。因此本試驗選擇乙酸銨-甲醇體系作為流動相。4種物質的色譜圖如圖1所示。

圖1 四種甜味劑的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the four kinds of sweeteners

由圖1可知，經過色譜條件的優化，4種物質峰型尖銳對稱、靈敏度高、專屬性強，且在6 min內可以完成全部物質的同時測定，因此該方法具有簡便、快速、準確的特點。各物質的MRM色譜圖見圖2。由圖2可知，4種甜味劑在Agillent EC-C18上有較好保留，且峰形對稱。

圖2 安賽蜜(A)、糖精鈉(B)、甜蜜素(C)、三氯蔗糖(D)的MRM色譜圖Fig.2 Multiple reactions monitoring chromatograms of acesulfame(A),saccharin sodium (B),sodium cyclamate (C) and sucralose (D)

2.3 標準曲線及方法檢出限

配制5ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL的混合標準使用溶液進行測定，繪制標準工作曲線。并根據信噪比S/N=3確定了4種甜味劑的檢出限，結果如表3所示。

表3 4種甜味劑的線性方程及檢出限Table 3 Linear equation and detection limits of the four kinds of sweeteners

從表3中可以看出，4種化合物在5～100 ng/mL線性范圍內線性良好，相關系數R2≥0.998 6，檢出限達到10-9級，方法靈敏度高。

2.4 方法的精密度和回收率試驗

向白酒樣品中分別添加4種甜味劑的高（50 ng/mL）、中（10 ng/mL）、低（5 ng/mL）3個質量濃度水平的標準溶液，進行精密度和回收率試驗，將每個質量濃度樣品平行測定6次，測定結果見表4。

表4 4種甜味劑的加標回收率和精密度試驗結果(n=6)Table 4 Recovery rates and precision test results of four sweeteners (n=6)

由表4可知，4種甜味劑的物質在高、中、低3個質量濃度水平的精密度試驗中相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.09%～4.64%，表明結果精密度良好，回收率在82.7%～117.62%，表明結果準確度高。結果表明，該方法能夠滿足白酒中安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、三氯蔗糖4種甜味劑的檢測需要。

2.5 不同樣品中甜味劑的檢測結果及其來源分析

應用本方法對成品酒、自產輪次酒、基酒、外購基酒、外購調味酒、自產曲藥、外購糖化酶等22個批次樣品進行了跟蹤檢驗排查，結果見表5。

表5 樣品中4種甜味劑的檢測結果Table 5 Determination results of four sweeteners in samples mg/kg

由表5可知，企業自身生產的成品酒、輪次酒及生產所用到曲藥和糖化酶的甜味劑檢出量非常低，遠遠低于國家標準檢出限（甜蜜素0.1 mg/kg、糖精鈉1.0 mg/kg、安賽蜜4.0 mg/kg、三氯蔗糖4.0 mg/kg），企業按照正常工藝生產，甜味劑的本底值是很低的，不存在誤判風險。

發現其外購的調味酒含有較高的甜味劑，其中甜蜜素含量為810.68 mg/kg，糖精鈉為405.34 mg/kg，遠遠超出國家標準規定的檢出限，從而導致成品酒中的甜味劑含量超標。

本研究針對調味酒進行檢測，在本省獲證白酒企業抽取調味酒13個批次進行追蹤檢驗，其中11個批次調味酒檢出甜味劑，甜蜜素檢出11個，其中7個超過0.1 mg/kg的國家標準規定的檢出限，糖精鈉檢出11個，其中1個超過1.0 mg/kg的國家標準規定的檢出限；安賽蜜檢出3個，其中1個超過4.0 mg/kg的國家標準規定的檢出限；三氯蔗糖檢出1個，沒有超過4.0 mg/kg的國家標準規定的檢出限，這也表明調味酒是帶入白酒甜味劑的主要原因，外購調味酒是造成成品酒甜味劑超標的較大的風險源。

對濃香型白酒及醬香型白酒的自產新酒樣、組合基酒、盤勾酒樣、醬香醇甜酒、待裝成品酒樣、典型成品酒樣、自產高溫大曲、中溫大曲等41個樣品進行檢驗排查，所有酒樣均未檢出甜味劑，在高溫大曲、中溫大曲中均檢出甜蜜素含量為0.03 mg/kg左右，其他甜味劑均低于方法檢出限。

對其他獲證企業自產或外購糖化酶采樣23個批次，進行了4種甜味劑的檢測，均檢出的低含量的甜蜜素和糖精鈉，其中，曲藥中甜蜜素檢測范圍在0.031～0.10 mg/kg，糖精鈉檢測范圍在0.007～0.040 mg/kg，這可能是曲藥在自身的發酵過程中會產生干擾物質，從而導致成品酒中甜味劑本底值的產生。但曲藥和成品酒的檢出值均低于行業標準SN/T 1948—2007《進出口食品中環己基氨基磺酸鈉的測定》規定的0.1 mg/kg的檢出限。

采用本方法對市售可能添加到白酒中的10個香料物質進行4種甜味劑的檢測，香料中4種甜味劑均未檢出。白酒生產中按固態發酵工藝生產不會引起甜味劑超標，但是通過外購基酒調味酒的方式卻會增大甜味劑檢出的風險，企業應采取有效手段對外購酒樣的質量進行控制，以保證白酒生產質量安全[18]。

3 總結

本研究建立了同時、快速檢測白酒及曲藥中安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、三氯蔗糖等4種甜味劑含量的高效液相色譜-質譜聯用檢測方法。白酒樣品經過超純水稀釋10倍后直接進樣，采用甲醇-乙酸銨溶液為流動相進行檢測，4種甜味劑在6 min內可達到完全分離，在5～100 ng/mL范圍內呈良好線性關系（相關系數R2≥0.998 6），檢出限為0.005～0.02 mg/kg，回收率為82.7%～117.62%，相對標準偏差為1.09%～4.64%，表明該方法靈敏度高、精密度及準確性良好。同時通過對白酒生產工藝的整個流程進行跟蹤檢測，發現曲藥在自身的發酵過程中會產生類似甜蜜素的干擾物質，從而導致成品酒中檢出微量甜蜜素。結果表明，該檢測方法快速靈敏，大大縮短了檢測周期和檢測成本，能夠及時為質監部門提供執法的科學依據。

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