高效液相色譜法測定納豆膠囊中的葛根素

胡雪蓮，劉 菲，王莉娜

（北京燕京啤酒集團公司技術中心 啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京 101300）

葛根是我國分布較廣的藥食同源植物，其藥用價值極高，素有“亞洲人參”之美譽，具有解肌退熱、生津透診、升陽止瀉等功能[1]。其有效成分葛根素（puerarin）化學名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4’,7二羥基異黃酮，分子質量為416.38 u[2]，由于其具有抗炎解熱、擴張冠狀動脈血管、增加冠狀動脈血流量及降低血壓等作用[3]，近年已被用于膠囊、口服液、片劑、保健茶等保健食品中。市場上的納豆作為一種功能性保健食品，具有溶血栓、抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗氧化性、防止骨質疏松、促凝血等對人體較高的生理功能及營養保健作用，正在被越來越多的消費者所關注[4]。葛根素作為功能性有效成分的一種，將其添加到納豆膠囊中可以更好的發揮擴張腦血管、降低膽固醇、改善血小板功能、抑制血小板凝集、降低血液粘稠度、改善微循環等功效。因此富含葛根素的納豆膠囊中葛根素的準確分析對保證產品質量、控制工藝過程具有十分重要的意義。目前國內外已有對原植物[3，5]、保健食品[6-7]及藥品[8-9]中葛根素含量測定的相關報道。而輔助添加了葛根提取物的納豆膠囊中葛根素含量分析并未見有關報道。納豆是黃豆經發酵而成的風味豆制品，其中富含大量蛋白、脂肪、粗多糖等成分，現市售護肝型納豆膠囊產品除添加了葛根提取物外，還添加有靈芝粉等，產品基質更為復雜，測定復雜基質樣品中的微量葛根素組分是一項困難的工作。關于葛根素的定量分析方法較多，如紫外分光光度法[8，10]、毛細管膠束電動力學色譜法[5，9]、薄層層析法[10-11]、熒光法、高效液相色譜（HPLC）法[12-14]等。本實驗建立了富含葛根素納豆膠囊產品中葛根素含量的高效液相色譜（high performance liquid chromatogrophy，HPLC）分析方法，該方法快速、簡便、準確可靠，重現性好，可用于納豆膠囊的質量控制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根素標準品：北京世紀奧科生物技術有限公司；甲醇（HPLC級）：美國Fisher公司；Milli-Q超純水：美國Milli-pore公司；乙酸（99.5%）（分析純）：北京化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

Waters 2489高效液相色譜儀（真空脫氣器、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、UV檢測器）：美國Waters公司；KQ-500DE型超聲振蕩器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準儲備溶液及使用液的配制

標準儲備溶液：精確稱取葛根素標準品200 mg于100 mL容量瓶中，用體積分數70%的甲醇水溶解定容，配制成質量濃度為2 000 mg/L的貯備液，于4 ℃冷藏備用。

標準使用液：將貯備液稀釋20倍，配制成100 mg/L的標準使用液，該溶液通過0.45 μm膜過濾，供HPLC測定。此溶液現配現用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX ODS C18（5 μm，4.6 mm×200 mm）；流動相：甲醇+36%乙酸+水（25+3+72）；流速：1 mL/min；等度洗脫；檢測波長：247 nm；柱溫：37 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.3 樣品的制備

將納豆膠囊脫去外殼，膠囊粉取出混勻，精密稱取25 mg樣品于25 mL容量瓶中，加入約15 mL體積分數70%的甲醇水溶液，超聲提取20 min后用甲醇水溶液定容混勻，靜置5 min，上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液供高效液相色譜（HPLC）分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇

由于納豆膠囊的劑型復雜，而且大部分又為復合組方，成分復雜。根據葛根素易溶于甲醇、水等極性溶劑的特性，采用不同體積分數的甲醇/水溶液超聲提取，提取液經0.45 μm水相膜過濾，實驗發現，體積分數70%的甲醇更能使葛根素提取完全，在除去蛋白質、脂肪等雜質，減少測定干擾方面效果很好，以此作為提取溶劑的樣品譜峰干凈，無雜質干擾，故選用體積分數70%的甲醇為樣品提取溶劑。

2.1.2 檢測波長的選擇

根據現有文獻[2，5-6]，葛根素分別在波長239 nm、250 nm、247 nm處有較大紫外吸收，在此基礎上，以現有的儀器條件試驗了以上3個波長條件下葛根素的響應值，確定在波長247 nm處葛根素有最大吸收。

2.1.3 流動相的選擇

分別比較了“甲醇-水”和“甲醇-36%乙酸-水”中性和酸性兩種流動相系統[7-10]，研究表明流動相為甲醇-36%乙酸-水（25∶3∶72）時，色譜峰形較好，保留時間適中，在此條件下葛根素的出峰時間為17.819 min，通過與標準的色譜圖對照，樣品中待測組分的色譜圖與標準的色譜圖匹配性很好，完全可以達到將待測組分與雜質峰完全分離的目的（見圖1），滿足分析的要求。

圖1 葛根素標準溶液(a)，樣品(b)，樣品加標(c)色譜圖Fig.1 Chromatogram of puerarin standard solution (a),sample (b)and sample standard addition (c)

2.2 線性關系和靈敏度

將標準貯備液以體積分數70%的甲醇為溶劑適當稀釋，配制成系列濃度梯度的標準溶液，在1.3.3條件下依次測定，以峰面積（y）為縱坐標，質量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸分析。其線性范圍為0～1 000.0 mg/L，回歸方程為y=70 364x+297 207，相關性系數R2為0.999 4，并以3倍信噪比，得出方法檢出限為4.5 mg/kg。結果表明線性良好，靈敏度較高（見圖2）。

圖2 葛根素標準曲線Fig.2 Standard curve of puerarin

2.3 精密度與回收率

精密稱取同一樣品6份，用上述方法處理、測定，葛根素含量分別為22.5 mg/g、21.8 mg/g、23.1 mg/g、22.9 mg/g、23.7 mg/g、21.4 mg/g，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.8%。分別選取納豆膠囊樣品，添加10 mg/g、20 mg/g、30 mg/g三個質量濃度的葛根素標準溶液，按本方法進行測定，結果（表1）表明，3個濃度的樣品加標回收率分別為96.6%～104.3%、103.2%～106.4%、97.5%～105.2%。本方法的準確度及精密度能滿足納豆膠囊中葛根素的分析要求。

表1 納豆膠囊樣品中葛根素的加標回收率Table 1 Recoveries of puerarin in the natto capsule

2.4 樣品的檢測與分析

按所建方法對統一品牌5個批次樣品進行檢驗，計算葛根素含量，結果見表2。從表2可以看出，該產品葛根素含量穩定在22.2～23.6 mg/g。

表2 納豆膠囊中的葛根素含量Table 2 Puerarin content in natto capsule

3 結論

在該方法條件下葛根素含量在0～1 000 mg/L范圍內線性較好，R2=0.999 4。本方法在10 mg/g、20 mg/g、30 mg/g三個含量的樣品加標回收率分別為96.6%～104.3%、103.2%～106.4%、97.5%～105.2%，檢出限為0.005 mg/g，本方法前處理簡便、準確度、精密度、回收率高、選擇性好、分離速度較快，能夠達到保健食品中功效成分的測定要求，經分批抽樣檢測葛根素含量符合要求，該方法可以用于納豆膠囊中葛根素含量的測定。

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