靈芝多糖的超聲輔助堿提工藝優化

王 鋒，羅麗蘭，張秀清*

（中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京 100083）

靈芝（Ganoderma lucidum）是食藥兩用真菌，在中國被稱為“仙草”，大量的藥理學研究與臨床實踐進一步證實靈芝的具有重要的藥理作用。靈芝多糖作為靈芝的主要成分之一，研究表明其具有抗腫瘤[1-4]、免疫調節[5-7]、抗氧化抗衰老[8-10]及降血糖血脂[11]等生物活性。

靈芝多糖有多種提取方式，包括水提醇沉法、堿提法、酶法、超聲及微波輔助提取法等[12-15]。傳統的方法是用熱水浸提法，該方法雖然操作簡單，但是多糖的提取效率和生產效率都比較低；另一種應用較多的靈芝多糖提取方法是堿提法，許多研究結果表明，堿提法與水提法比較，能夠極大的提高靈芝多糖得率[16]。超聲提取法作為一種輔助手段經常被應用到溶劑提取法中增加提取效果，大量的實驗結果表明，若在提取過程中加入超聲進行輔助，可以極大的提高靈芝多糖的產率[17-18]。

本實驗的目的是得到一種能夠顯著提高靈芝多糖提取率的提取方法，對超聲輔助堿提靈芝多糖的工藝進行了優化，并將該工藝應用到靈芝子實體多糖的提取中，與傳統水提法結果進行比較，以確定該方法的高效性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝菌種：采自四川、安徽、東北、浙江四個地區；無水乙醇、苯酚、濃硫酸等（分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設備

KQ3200DE 數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器廠；TG 16-WS臺式高速離心機：長沙湘儀離心機有限公司；PB-10酸度計：德國Sartourius公司。

1.3 方法

1.3.1 靈芝多糖超聲輔助堿提工藝優化

（1）靈芝多糖超聲輔助堿提工藝流程

靈芝菌絲體→粉碎→過60目篩→加入5%的NaOH溶液→超聲提取→熱水浴浸提→離心分離（4 000 r/min、15 min）→取上清液，調節pH值至7左右（6.8～7.2）→加入4倍體積無水乙醇→4 ℃中保存過夜→離心（4 000 r/min、15 min）→棄去上清液→沉淀揮發干燥→復溶于水→定容→多糖提取液

（2）葡萄糖標準曲線的繪制及樣品多糖含量的測定

采用苯酚硫酸法進行測定[19]，標曲繪制方法：準確稱取105 ℃干燥至質量恒定的葡萄糖1.000 g，用蒸餾水定容至100 mL，取出1 mL該溶液定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。準確吸取標準溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于比色管中，各加蒸餾水使體積為2.0 mL。再各加入6%的苯酚1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL。靜置10 min后，搖勻，待反應液完全冷卻后，于波長490 nm條件下測定其吸光度值，以蒸餾水作為空白。

準確吸取靈芝多糖提取液1 mL，按照標準曲線繪制的方法操作。以空白試劑作參比，在波長490 nm處測定吸光度值，按照標準曲線回歸方程計算樣品中多糖含量。多糖含量按如下公式計算：

式中：w為多糖含量，mg/g；m1為從標準曲線上查到的樣品測定液的葡萄糖含量，mg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品的質量，g；V2為比色時所移取樣品測定液的體積，mL。

（3）靈芝多糖超聲輔助堿提工藝的單因素試驗

對堿提靈芝多糖過程中料液比、超聲時間、超聲功率、水浴熱提溫度、水浴熱提時間5個因素進行單因素設計。料液比選擇1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）；超聲功率選擇60 W、75 W、90 W、105 W、120 W、135 W、150 W；超聲時間選擇10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min；水浴熱提取溫度選擇40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃；水浴熱提時間選擇40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min。分別考察料液比、超聲時間、超聲功率、水浴熱提溫度、水浴熱提時間對多糖含量的影響。

（4）靈芝多糖超聲輔助堿提工藝的正交優化試驗

在單因素試驗的基礎上，對料液比、超聲功率、超聲時間、水浴提取溫度和水浴提取時間這5個因素分別選擇4個水平，進行正交試驗，因素與水平見表1。

表1 多糖提取工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for polysaccharides extraction technology optimization

1.3.2 靈芝多糖傳統熱水提取工藝

參照文獻[20]的方法，對其稍作修改：稱取0.5 g粉碎后過60目篩的樣品粉末置于50 mL具塞離心管內，用5 mL水浸潤樣品，緩慢加入20 mL無水乙醇，混勻后將樣品置于超聲提取器中（90 W）提取30 min后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清，不溶物用10 mL體積分數為80%的乙醇洗滌離心，用水將上述不溶物轉移至圓底燒瓶，加入50 mL 蒸餾水，裝上磨口的空氣冷凝管，于沸水浴中提取2 h后冷卻至室溫，過濾，將上清移至100 mL容量瓶中，洗滌殘渣2～3次，用蒸餾水水定容。

1.3.3 靈芝多糖超聲輔助堿提優化工藝的應用

對四川、安徽、東北和浙江4個產地的靈芝子實體多糖分別利用1.3.1中得到的優化工藝和1.3.2的傳統水提方法進行提取，比較兩種工藝對靈芝子實體多糖提取率的差異。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的建立

以多糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，結果如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標準曲線方程為y=5.506 6x-0.022 6，相關系數R2為0.999 7，表明二者線性關系良好。

2.2 料液比對多糖提取的影響

圖2 料液比對多糖含量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides content

由圖2可知，不同的料液比對靈芝多糖的含量之間存在顯著性差異。多糖提取率隨料液比的增加而上升，料液比為1∶50（g∶mL）時多糖含量達到最高，為67.5 mg/g，之后多糖的提取率趨于穩定。由此可得出料液比為1∶50（g∶mL）時，多糖含量最高。

2.3 超聲功率對多糖提取的影響

圖3 超聲功率對多糖含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on polysaccharides content

由圖3可知，堿提取靈芝菌絲體多糖含量隨著超聲功率的上升呈現波浪形的趨勢，不同的超聲功率所得到的多糖含量差異不顯著。在超聲功率為120 W時，多糖含量最大，為64.0 mg/g。由此可得，超聲功率120 W時對靈芝多糖的提取效果最佳。

2.4 超聲時間對多糖提取的影響

圖4 超聲時間對多糖含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on polysaccharides content

由圖4可知，超聲時間對堿提取靈芝菌絲體多糖的影響不明顯，提取時間為20 min時，多糖含量最大，為61.7 mg/g。隨著超聲時間的延長，靈芝菌絲體多糖含量有所下降。由此可得，超聲時間20 min對靈芝多糖的提取效果最佳。

2.5 水浴熱提取溫度對多糖提取的影響

由圖5可知，靈芝菌絲體多糖提取量隨水浴溫度的上升而上升，水浴提取溫度對靈芝菌絲體多糖的影響程度較大。提取溫度為100 ℃時多糖提取量達到最大值63.5 mg/g。因此，從經濟角度考慮，可以選擇80 ℃提取靈芝菌絲體多糖。

圖5 提取溫度對多糖含量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on polysaccharides content

2.6 水浴熱提取時間對多糖提取的影響

圖6 提取時間對多糖含量的影響Fig.6 Effect of extraction time on polysaccharides content

由圖6可知，熱提取時間對堿提靈芝菌絲體多糖的影響較大，隨著提取時間的增加，靈芝菌絲體多糖的提取量上升。在水浴提取80 min時達到最大值，菌絲體多糖的提取量為60.5 mg/g，之后有所下降。由此可得，選擇水浴提取80 min提取靈芝菌絲體多糖為宜。

2.7 靈芝多糖超聲輔助堿提工藝正交優化試驗

根據單因素試驗結果，各因素分別選擇4個水平進行正交試驗。結果與分析見表2，方差分析結果見表3。

由表2可知，對靈芝菌絲體多糖提取的影響因素主次順序為E＞D＞C＞B＞A，即熱提溫度＞熱提時間＞超聲時間＞超聲功率＞料液比，最優靈芝菌絲體提取靈芝多糖的組合是A2B3C1D3E4，即料液比為1∶40（g∶mL），超聲功率105 W，超聲時間20 min，水浴溫度100 ℃，水浴提取時間80 min。在此最佳工藝條件下，多糖含量為67.8 mg/g。

由表3可知，影響超聲輔助堿提取靈芝多糖含量的5個因素中，熱提取時間和熱提取溫度影響極顯著，超聲時間和超聲功率影響顯著，料液比對其影響不顯著。

表2 多糖提取工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for polysaccharides extraction technology optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

2.8 靈芝多糖超聲輔助堿提優化工藝的應用

由圖7可知，對于4個產地的靈芝子實體的多糖，采用優化得到的靈芝多糖超聲輔助堿提工藝進行提取，其多糖含量均＞60 mg/g，最高達90 mg/g以上；而采用傳統的熱水提取法，4個產地的樣品中多糖含量均在30～40 mg/g之間。因此，實驗得到的超聲輔助堿提工藝能顯著提高多糖含量。

圖7 不同產地靈芝堿提與水提多糖含量對比Fig.7 Comparison of polysaccharides contents of Ganoderma lucidum from different regions by alkaline extraction and water extraction

3 結論

靈芝多糖作為一種具有多種生理活性的物質，研究提高其提取率的方法具有重要的價值。本研究通過單因素試驗和正交試驗，對超聲輔助堿提取靈芝多糖的工藝進行了優化，得到最佳的提取工藝為料液比為1∶40（g∶mL），超聲功率105 W，超聲時間20 min，水浴提取溫度100 ℃，水浴提取時間80 min，該工藝得到的多糖含量達到了67.8 mg/g。并確定水浴提取時間和水浴提取溫度為極顯著性因素，超聲時間和超聲功率為顯著性因素，料液比為不顯著因素。隨后將該工藝應用到靈芝子實體多糖的提取中，對浙江、東北、四川以及安徽四個地區采集到的靈芝子實體中的多糖分別用堿提法和水提法進行測定，結果顯示該優化工藝的多糖提取率是水提法的1.5～3.0倍。本試驗得到的靈芝多糖超聲輔助堿提工藝能顯著提高靈芝多糖的提取率，對現實生產具有一定的指導意義。

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