響應面法優化蜂蜜酒發酵工藝

彭 濤，馬文錦，王貴春，金 紅，殷 欣，張 輝，白艷茗

（1.甘肅省輕工研究院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

蜂蜜酒有近3 000年的文化底蘊，是貴族酒的一種。蜂蜜酒是以蜂蜜作為原料，經過發酵得到的酒精飲料，不僅保留了天然蜂蜜營養成分和保健功能，而且提高了氨基酸，維生素、礦物質等重要生理活性物質的含量，有很好的營養保健功效[1-3]。

我國蜂蜜年產量約為43萬t，盡管產量大，但是對蜂蜜酒的研究起步較晚，生產規模小且生產廠家較少，生產工藝也比較落后，產量有限，滿足不了國內外市場的大量需求，市場前景良好[4-6]。葡萄糖、果糖和蔗糖均為蜂蜜中的主要成分，可作為酵母所直接利用的發酵底物，本試驗對蜂蜜酒發酵工藝進行優化，建立一套成熟的蜂蜜酒發酵工藝，最終獲得品質優良的蜂蜜酒產品，以滿足人們對天然蜂蜜發酵產品的消費需求，增加了蜂產品的種類，開拓蜂蜜產品消費市場，同時也為蜂產品開辟了一條新的發展途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狼牙蜂蜜（糖度75°Bx）：購于陜西省寶雞市；釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；檸檬酸：天津市科密歐化學試劑有限公司；蛋白酶：蘇柯漢（濰坊）生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

PYXDHS-50型恒溫培養箱：上海躍進醫療器械廠；LDZF-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械有限公司；DK-98-I電子恒溫水浴鍋：余姚市東方電子儀器廠；WZ101手持糖度計：浙江托普儀器有限公司；PHS-2C型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；AR2140型電子分析天平：奧豪斯國際貿易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蜂蜜酒加工工藝流程

1.3.2 發酵工藝參數優化單因素試驗

初始糖度的確定：以無菌水稀釋蜂蜜以達到相應的糖度，設定糖度分別為5°Bx、15°Bx、25°Bx、35°Bx、45°Bx，根據蜂蜜酒的綜合評價，確定其最適發酵糖度[7]。

發酵液pH值的確定[8]：采用檸檬酸調節發酵液的pH值，分別調節至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，根據蜂蜜酒的綜合評價，確定其最適發酵pH值。

發酵溫度的確定：設定發酵溫度為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，根據蜂蜜酒的綜合評價，確定其最適發酵溫度。

1.3.3 Box-Behnken中心試驗設計及響應面法優化蜂蜜酒發酵工藝

在單因素試驗基礎上，將處理好的蜂蜜汁進行發酵，選取發酵液糖度、發酵pH值、發酵溫度3個因素，以產品綜合指標（Y）為響應值，進行響應面分析，響應面分析試驗因素水平見表1。

表1 蜂蜜酒發酵工藝優化響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for honey wine fermentation technology optimization

1.3.4 蜂蜜酒綜合評價方法

對蜂蜜酒的色澤、香氣、口感和后味等感官特性及產品指標進行綜合評價，滿分100分，評分方法及依據綜合參考國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》、GB/T 5009.49—2008《發酵酒及其配制酒衛生標準的分析方法》、GB/T 4789.25—2003《食品衛生微生物學檢驗酒類檢驗》[9-11]。綜合評價標準如表2所示。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜酒發酵初始糖度的確定

發酵液中糖度過高，一方面會阻遏乙醇產生途徑中乙醇脫氫酶的活性而抑制發酵，不利于酒精產物的積累；另一方面會造成高滲透壓環境而抑制酵母的生長[12]。發酵液糖度過小又會使酵母生長緩慢，并且糖分幾乎全為酵母生長所用，酒精發酵不能正常進行，幾乎不能產生酒精。蜂蜜中含糖量極高，必須予以合理的稀釋，使發酵液的糖度達到合理的范圍才能既利于酵母的生長又利于發酵產物的積累。由圖1可以看出，在一定范圍內，隨著糖度的增加，蜂蜜酒的綜合評分增加，隨后呈現下降趨勢。糖度為5°Bx時，所發酵蜂蜜酒酒香不足，口味酸澀，綜合指標為60分；而糖度為25°Bx時，所發酵的蜂蜜酒清亮透明，酒味濃厚協調，甘甜爽口，蜂蜜酒品質達到較理想狀態，綜合指標為88分。糖度＞25°Bx時，影響酵母生長，導致成品風味不足。因此選擇初始糖度25°Bx為宜。

2.2 蜂蜜酒發酵液pH值的確定

發酵液pH是影響酵母生長的重要因素，酸性或堿性過強都會抑制其生長，而酵母的生長情況是發酵工藝中的關鍵，直接影響產品品質，因此，合理pH值的選取至關重要。由圖2可知，當pH值為3.0時，蜂蜜酒渾濁、入口蜜甜、無酒香，綜合指標63分；隨著pH值的增大，蜂蜜酒品質發生顯著變化，當pH值為5.0時，蜂蜜酒清亮透明、酒味濃厚、甘甜爽口、后味足，蜂蜜酒品質達到較理想狀態，綜合指標為86分。當pH值＞5.0時，產品綜合指標下降。因此選擇發酵pH 5.0為宜。

2.3 蜂蜜酒發酵溫度的確定

溫度對發酵起著決定性的作用，直接表現為糖的消耗，間接影響口感和芳香物質的形成，溫度是發酵參數控制中的重中之重[13-15]。圖3為發酵溫度對蜂蜜酒綜合指標的影響。由圖3可知，溫度過高或過低都會影響蜂蜜酒的發酵，降低產品品質，當溫度為25 ℃時，蜂蜜酒清亮透明，酒香濃郁，口味醇香，產品品質達到較理想狀態，綜合指標為84分。因此選擇發酵溫度25 ℃為宜。

圖3 發酵溫度對蜂蜜酒品質的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on honey wine quality

2.4 蜂蜜酒發酵工藝優化

2.4.1 Box-Behnken中心試驗設計及響應面法優化蜂蜜酒發酵工藝

Box-Behnken試驗設計方案及結果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設計方案及試驗結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

2.4.2 模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert軟件對表3中試驗數據進行二次線性回歸擬合，得到數學模型，并對模型進行方差分析，結果見表4，對各因素進行二次多項式回歸擬合后，得到二次多項回歸方程：

表4 回歸統計分析結果Table 4 Results of regression statistical analysis

由表4可知，模型極顯著（P＜0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.982 2），表明所建立的模型可以用來解釋98.22%的響應變化，模型調整確定系數0.959 3，說明該模型能解釋95.93%響應值的變化，只有4.07%的總變異沒有包括其中，擬合程度較好，失擬項不顯著（P＞0.01），說明本試驗所得二次回歸方程高度顯著，能夠很好地對響應值進行預測。二次項A2與C2影響極顯著，B2影響顯著，而發酵液糖度影響最大，且所考察因素對響應值影響不是簡單的一次線性關系。

2.4.3 蜂蜜酒發酵響應面分析及優化

通過Design-Expert軟件分析，得到響應面及等高線圖（見圖4），可直觀反映各因素間的交互作用對響應值的影響，其中等高線的形狀可反映出交互效益的強弱，橢圓形表示兩因素之間交互作用顯著，圓形則與之相反。

利用Design-Expert軟件分析得到最優發酵條件，當糖度為25.06°Bx、發酵溫度為24.60 ℃、pH值為5.00時，蜂蜜酒綜合指標為86.1分，即各因素選取最優值后所得最大響應值。考慮到實際操作性，設定糖度為25°Bx、發酵溫度為25 ℃、pH值為5.0。對以上最優工藝進行5批驗證試驗，綜合指標平均值為86.7分，表明預測值與試驗平均值結果基本一致，故確定蜂蜜酒發酵最優工藝：糖度為25 °Bx、發酵溫度為25 ℃、pH值為5.0。

圖4 初始糖度、發酵pH值以及溫度交互作用對蜂蜜酒感官評分影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effect of interaction between initial sugar content,pH and temperature on sensory evaluation score of honey wine

3 結論

在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken中心試驗設計及響應面法確定了蜂蜜酒的最佳發酵工藝：發酵液初始糖度為25 °Bx、發酵溫度為25 ℃、發酵pH值為5.0。在此工藝條件下所釀造的蜂蜜酒綜合評價分數為86.7分，品質最佳，具有獨特的風味。

[1]傅國城.蜂蜜酒釀造工藝技術的研究與應用[J].釀酒，2014，41（4）：90-93.

[2]曾志將.養蜂學[M].北京：中國農業出版社，2009.

[3]張麗珍，曾志將，顏偉玉，等.山烏桕蜂蜜酒的釀造工藝研究[J].中國釀造，2010，29（9）：180-182.

[4]翟文俊.蜂蜜酒的營養價值與保健作用[J].食品科技，2004，30（8）：62-65.

[5]李 禮，陳尚武，張 文，等.葡萄酒酵母和酵母營養物對蜂蜜酒發酵的影響[J].釀酒，2005，32（2）：68-70.

[6]馬美范.蜂蜜發酵酒的研制[J].食品研究與開發，2013，34（4）：47-49.

[7]劉功良，馬 磊，陳華玲，等.荊條蜜酒發酵工藝的研究[J].中國釀造，2014，33（6）：157-160.

[8]黃根樹，張慶華.紅棗蜂蜜保健酒的釀造工藝研究[J].中國釀造，2014，33（5）：161-164.

[9]中華人民共和國衛生部，國家標準化管理委員會.GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京：中國標準出版社，2006.

[10]中華人民共和國衛生部，國家標準化管理委員會.GB/T 5009.49—2008發酵酒及其配制酒衛生標準的分析方法[S].北京：中國標準出版社，2008.

[11]中華人民共和國衛生部，國家標準化管理委員會.GB/T 4789.25—2003食品衛生微生物學檢驗酒類檢驗[S].北京：中國標準出版社，2003.

[12]劉 磊，吳 暉，劉冬梅，等.黃酒生產用酵母的分離與篩選[J].現代食品科技，2007，23（7）：5-8.

[13]王 淼.蜂蜜酒發酵參數控制研究[J].蜂蜜雜志，2005（11）：5-6.

[14]王準生，伍佳琪.天麻、刺梨、蜂蜜復合發酵酒的研制[J].中國釀造，2006，25（1）：76-78.

[15]馬榮山，郭 丹.流加法發酵生產較高酒精度蜂蜜酒[J].中國釀造，2008，27（21）：56-59.