[Bmim]BF4-Na2SO4雙水相體系萃取葡萄皮渣中齊墩果酸

張挺峰，張喜峰*，張芬琴

（河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000）

甘肅河西走廊地處北緯36～40°，具有種植葡萄尤其是釀造葡萄的最佳光、熱、水、土資源組合狀態。在葡萄酒加工過程中，產生約占葡萄加工量20%～30%的皮渣廢棄物，其中主要是葡萄皮、葡萄籽和果梗等。目前，已從葡萄皮渣中提取到多種多酚類物質（如天然花色苷類、原花青素、白藜蘆醇、齊墩果酸等成分[1]），其中齊墩果酸為五環三萜類化合物，具有護肝降酶[2]、降脂降糖[3]、抗突變[4]、抗癌及增強免疫[5]等作用。由于齊墩果酸結構復雜，很難人工合成，多從天然產物中提取制得。因此，開展葡萄皮渣的綜合利用，不僅可以獲得良好的經濟效益，而且能夠有效地減輕環保壓力，獲得巨大的社會效益。

目前齊墩果酸提取方法主要有乙醇回流法[6]、微波輔助提取法[7]、超聲波輔助提取法[8]、超臨界萃取法[9]等。這些提取方法或存在提取效率較低、溶劑殘留、毒性較大，或存在設備要求高、能耗高、成本高等缺點。近年來，由于雙水相萃取技術具有高效、溫和、操作簡便、容易放大和能有效保持生物活性等優點，被廣泛應用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領域，涉及到細胞、膜、病毒、蛋白質、核酸等生物產品以及其他天然藥物有效成分的分離和純化[10-13]。但傳統的雙水相體系具有原料成本較高、高聚物回收利用困難等缺點。隨著對雙水相技術研究的不斷深入，離子液體-鹽雙水相體系（ionic liquid-aqueous two phase system，IL-ATPS）具有使用溫度及酸度范圍寬、黏度相對較低、分相迅速、界面清晰、萃取過程不發生乳化現象、選擇性和專一性較高、不使用揮發性有機溶劑以及環境友好等優點[14]。因此，利用這項技術可為從天然植物中提取有效活性成分開辟一條嶄新的思路。

本研究以葡萄皮渣為原料，采用離子液體雙水相體系萃取葡萄皮中齊墩果酸，分別對1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate，[Bmim]BF4）質量分數、Na2SO4質量分數、齊墩果酸質量分數、萃取溫度、pH值、低級醇添加量對齊墩果酸萃取率的影響進行了研究，以期為葡萄皮渣資源深層次開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄皮渣：取甘肅濱河食品工業集團葡萄酒下腳料，經挑選、清洗、曬干，得到干凈的葡萄皮渣。

齊墩果酸標準品（純度＞99%）：國藥集團化學試劑有限公司；香草醛、冰乙酸：天津百世化工有限公司；無水乙醇：安徽安特食品股份有限公司；丙酮、濃鹽酸：北京化工廠；1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[Bmim]BF4）：中國科學院蘭州化學物理研究所；硫酸鈉（Na2SO4）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；異丙醇、正丁醇、甲醇：上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PL-203型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；XO-SM5O型超聲波-微波反應系統：南京先歐儀器制造有限公司；722型分光光度計：上海光譜儀器有限公司。雷磁PHSJ-5型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 齊墩果酸粗提取物的制備

準確稱取50 g葡萄皮渣粉末，以1∶10（g∶mL）的料液比加入體積分數為90%的乙醇，在超聲波反應系統（325 W、25 kHz）中超聲5 min，5 000 r/min離心10 min，上清液為含齊墩果酸粗提液，對其進行減壓濃縮，真空干燥，得到葡萄皮齊墩果酸粗提取物。

1.3.2 雙水相萃取方法[14]

稱取一定量[Bmim]BF4、Na2SO4、葡萄皮齊墩果酸粗提物、蒸餾水于小燒杯中，使雙水相體系總質量為10.00 g，充分振蕩使成相物質溶解，并調節體系pH值，靜置10 min，兩相達到相分離，葡萄皮渣齊墩果酸富集于雙水相系統的上相中，測定葡萄皮渣齊墩果酸的上下相體積和質量濃度，其相比R、分配系數K及萃取率Y的計算公式如下：

式中：R為相比；Vt、Vb分別為上、下相體積，mL。

式中：K為分配系數；Ct、Cb分別為上、下相齊墩果酸質量濃度，μg/mL。

式中：Y為萃取率，%；R為相比；K為分配系數。

1.3.3 齊墩果酸標準曲線的繪制[15]及含量測定方法

精密稱取齊墩果酸標準品0.025 g，置于250 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容至刻度，得質量濃度為100 μg/mL的標準溶液，吸取標準溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL置于具塞試管中，于80 ℃水浴上揮去乙醇，按香草醛-高氯酸法顯色，用乙酸乙酯定容至10 mL，搖勻，靜置10 min，在波長547 nm處測定吸光度值。以質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，得標準曲線方程：y=0.036 2x-0.001 2（R2=0.999 5），根據回歸方程計算樣品中齊墩果酸含量。

1.3.4 [Bmim]BF4-Na2SO4雙水相體系的確定

通過測定不同質量分數的[Bmim]BF4和Na2SO4組成的雙水相體系對葡萄皮渣齊墩果酸萃取率和分配系數的影響，確定雙水相體系的組成。

1.3.5 葡萄皮渣齊墩果酸萃取因素的確定

在確定了雙水相體系組成后，分別研究齊墩果酸質量分數、萃取溫度、體系pH值、低級醇對齊墩果酸萃取率和分配系數的影響，進而確定葡萄皮渣齊墩果酸的最佳提取條件。

2 結果與分析

2.1 [Bmim]BF4質量分數對葡萄皮齊墩果酸萃取效果的影響

在[Bmim]BF4-Na2SO4雙水相體系中，選擇質量分數分別為16%、18%、20%、22%、24%的[Bmim]BF4，與質量分數為18%的Na2SO4組成雙水相體系，齊墩果酸質量分數為10%，在室溫（25 ℃）條件下，攪拌使兩相充分混勻，考察[Bmim]BF4質量分數對葡萄皮渣齊墩果酸萃取效果的影響，結果見圖1。

圖1 [Bmim]BF4質量分數對齊墩果酸萃取效果的影響Fig.1 Effect of [Bmim]BF4concentration on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由圖1可知，隨著[Bmim]BF4質量分數的增加，葡萄皮渣中齊墩果酸萃取率Y和分配系數K都增加，當[Bmim]BF4質量分數達到18%時，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數K均達到最高，分別為96.23%和16.21，此后，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數K都明顯下降，這是因為離子液體[Bmim]BF4咪唑環上有π電子體系能夠與齊墩果酸π電子形成π-π相互作用，促使齊墩果酸轉移至離子液體相中。當離子液體[Bmim]BF4質量分數過大（＞18%）時，黏度增加，影響兩相傳質。因此，選用[Bmim]BF4質量分數為18%進行后續試驗。

2.2 Na2SO4質量分數對葡萄皮齊墩果酸萃取效果的影響

在[Bmim]BF4-Na2SO4雙水相體系中，選擇質量分數分別為12%、14%、16%、18%、20%的Na2SO4，與質量分數為18%的[Bmim]BF4組成雙水相體系，齊墩果酸質量分數為10%，室溫（25 ℃）條件下，攪拌使兩相充分混勻，考察Na2SO4質量分數對葡萄皮渣齊墩果酸的萃取效果的影響，結果見圖2。

由圖2可知，隨著Na2SO4質量分數的增加，齊墩果酸在離子液體雙水相中萃取率Y和分配系數K均呈現先上升后下降的趨勢，這是因為隨著Na2SO4質量分數的增加，下相結構性逐漸增強，而富含離子液體的上相結構性較差，更容易形成空腔來容納齊墩果酸[18]。當Na2SO4質量分數達到16%時，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數K均達到最高，分別為96.92%和15.1。當Na2SO4質量分數＞16%以后，可能由于鹽析作用，造成萃取率Y和分配系數K下降。因此，選用Na2SO4的質量分數為16%進行后續試驗。

圖2 Na2SO4質量分數對齊墩果酸萃取效果的影響Fig.2 Effect of Na2SO4concentration on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

2.3 齊墩果酸質量分數對葡萄皮齊墩果酸萃取效果的影響

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4雙水相體系中，加入齊墩果酸使其最終質量分數分別為8%、10%、12%、14%、16%，在室溫（25 ℃）條件下，攪拌使兩相充分混勻，考察齊墩果酸質量分數對葡萄皮渣齊墩果酸的萃取效果的影響，結果見圖3。

圖3 齊墩果酸對齊墩果酸萃取效果的影響Fig.3 Effect of oleanolic acid concentration on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由圖3可知，隨著齊墩果酸質量分數逐漸增加，齊墩果酸萃取率Y和分配系數K逐漸增加，當齊墩果酸質量分數達到10%時，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數K達到最大值，分別為95.89%和15.85。齊墩果酸質量分數＞10%，萃取率Y和分配系數K呈明顯下降趨勢，這可能是齊墩果酸在離子液體相溶解已經達到飽和，從而增加了它在鹽相中溶解量，導致萃取率Y和分配系數K的下降。因此，選用齊墩果酸質量分數為10%進行后續試驗。

2.4 萃取溫度對葡萄皮中齊墩果酸萃取效果的影響

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4雙水相體系中，加入質量分數為10%齊墩果酸，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃條件下攪拌使兩相充分混勻，考察萃取溫度對葡萄皮渣齊墩果酸的萃取效果，結果見圖4。

圖4 萃取溫度對齊墩果酸萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由圖4可知，隨著萃取溫度的逐漸升高，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數K逐漸下降，這可能是陰離子BF4-1在較高溫度條件下發生水解，導致[Bmim]BF4在離子液體相中的濃度降低，從而導致齊墩果酸的萃取率Y和分配系數K逐漸下降。在室溫條件下，陰離子BF4幾乎不發生水解，該結果與ZAFARANI-MOATTAR M T等[19]研究結果是一致的，在萃取溫度為25 ℃時，齊墩果酸的Y和K達到最大值，分別為95.2%和17.95。因此，選用萃取溫度為25℃進行后續試驗。

2.5 pH對葡萄皮中齊墩果酸萃取效果的影響

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4雙水相體系中，加入質量分數為10%齊墩果酸，用HCl和NaOH調節體系pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，室溫（25 ℃）條件下，攪拌使兩相充分混勻，考察體系pH對葡萄皮渣齊墩果酸萃取效果的影響，結果見圖5。

圖5 p H對齊墩果酸萃取效果的影響Fig.5 Effect of pH on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由圖5可知，隨著體系pH逐漸升高，齊墩果酸的萃取率Y和分配系數K先增大后減小，當pH值為4.0時，萃取率Y和分配系數K達到最大值，分別為93.69%和15.49。主要原因是隨著pH變化，齊墩果酸和離子液體之間靜電平衡被破壞，因齊墩果酸為一元有機弱酸HA，易導致有機酸解離HA≒H++A-，為使分子形式的齊墩果酸存在于離子液體相，電離平衡必須向左進行，因此，雙水相體系必須有一個酸性環境。因此，選擇體系pH值為4.0進行后續試驗。

2.6 低級醇對葡萄皮中齊墩果酸萃取率效果的影響

在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4雙水相體系中，加入質量分數為10%齊墩果酸，分別加入體積分數為2%的甲醇、無水乙醇、異丙醇和正丁醇，調節體系pH值為4.0，在室溫（25 ℃）條件下，攪拌至兩相充分混勻，考察低級醇對葡萄皮渣齊墩果酸萃取效果的影響，結果見圖6。

圖6 低級醇對齊墩果酸萃取效果的影響Fig.6 Effect of short-chain alcohol on partition coefficient and extraction efficiency of oleanolic acid

由圖6可知，在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4體系中，與不加醇比較，無水乙醇的加入使得萃取率Y和分配系數K最大，分別為97.86%和16.29。這可能是[Bmim]BF4的極性與無水乙醇最為相似，而甲醇、異丙醇、正丁醇的加入反而使得萃取率Y和分配系數K降低，是由于低級醇的加入，取代了體系中的一部分水，使相間界面張力及電位差發生了變化，從而改變了齊墩果酸在兩相間的分配。因此，選擇在[Bmim]BF4-Na2SO4體系中加入體積分數2%無水乙醇。

3 結論

采用[Bmim]BF4-Na2SO4雙水相體系萃取葡萄皮中齊墩果酸，考察了[Bmim]BF4、Na2SO4質量分數、齊墩果酸質量分數、萃取溫度、pH、低級醇對葡萄皮齊墩果酸萃取過程中分配系數K及萃取率Y的影響，確定離子液體雙水相萃取葡萄皮中齊墩果酸的最佳條件：在18%[Bmim]BF4-16%Na2SO4雙水相體系中，室溫（25 ℃）條件下，加入質量分數10%齊墩果酸、體積分數2%無水乙醇，調節體系pH 4.0，齊墩果酸萃取率Y為97.9%，分配系數K為16.58。

離子液體雙水相萃取技術具有體系相間張力較低、分離條件溫和、可控制乳化現象等優點，使得離子液體/鹽雙水相的實際應用更具現實可能性，有望開辟萃取技術應用的新途徑。但人們對分離體系中各組分在離子液體-雙水相體系（IL-ATPS）中的相互作用、各組分的分配情況及其機理的了解還不深入和全面，因此迫切需要對萃取分離方面進行系統的理論和應用研究，使之形成完善的體系。

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