酮基還原酶基因工程菌發酵特性的研究

張 松，李 嘯， *，石小丹，程 奔

（1.三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌 443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

手性醇是手性藥物合成的重要中間體，例如（R）-（+）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯（ethyl（R）-（+）4-chloro-3-hydroxybutanoate，（R）-CHBE）是非常重要的手性中間體[1]，它可用于合成阿伐他汀鈣系列的藥物如L-肉毒堿[2]、大環內酯A和（R）-γ-氨基-β-羥基丁酸[（R）-γ-amino-β-hydroxybutyric acid，GABOB]等[3]。

微生物法催化酮類化合物制備手性醇具有效率高、選擇性強、成本低、裝置簡單、環境污染少等顯著優勢，受到了人們的廣泛關注[4]。微生物來源的酮基還原酶（ketoreduetase，KR）主要為醛酮還原酶系[5]，屬于短鏈醇脫氫酶家族（shortchain alcohol dehydrogenase，SDR）。重組大腸桿菌酮基還原酶一般為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴型，當KR 與NADPH 結合時，KR空間結構發生改變，執行由NADPH提供的、Tyr151 羥基介導的質子轉移，完成酮類化合物的還原[6]。目前的研究主要集中于酮基還原酶的基因改造、輔酶再生以及生物催化過程優化[4]，而對于酮基還原酶發酵調控方面的報道較少。

大腸桿菌高密度發酵是現代發酵領域逐漸興起的一項新技術，基因重組改造過的工程菌只有經過進一步的高密度發酵優化，才能應用于實際的工業生產[7]。當前有關酮基還原酶發酵方面的研究仍然停留在搖瓶發酵水平，要想酮基還原酶真正能用于工業發酵，中試水平的酮基還原酶高密度發酵產酶研究無疑具有重要意義。課題主要對重組大腸桿菌發酵生產酮基還原酶的發酵特性進行了研究，以確定重組菌株菌體生長狀況、發酵液重要參數指標、菌體產酶情況以及質粒的穩定性。為了進一步考察發酵特性曲線和質粒穩定性，采用流加氨芐的策略進行了補料分批發酵，并進行了多參數相關分析和前后兩罐對比分析。實驗為后續發酵過程優化以及生產放大奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

重組大腸桿菌（Escherichia coli）KR-C：安琪酵母股份有限公司菌種室。

1.1.2 試劑

L-阿拉伯糖：美國Sigma 公司；酵母蛋白胨（FP101）、酵母抽提物（FM888）：安琪酵母股份有限公司；氨芐西林鈉（注射用）：中諾藥業（石家莊）有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

斜面培養基：酵母蛋白胨（FP101）10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母抽提物（FM888）5 g/L，瓊脂粉15 g/L。

種子搖瓶液體培養基：甘油10 g/L，酵母抽提物13.5g/L，酵母蛋白胨31.5 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，MgSO40.5 g/L。

50 L發酵罐液體培養基：甘油20 g/L，酵母抽提物13.5 g/L，酵母蛋白胨31.5 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，MgSO40.5 g/L。

1.1.4 補料溶液

L-阿拉伯糖：質量濃度0.1 g/mL；氨芐西林鈉：質量濃度0.1 g/mL。

1.2 儀器與設備

ZHWY-211D腳踏開門型大容量全溫度恒溫搖床：上海智城生物科技有限公司；FUS-50L（A）型新概念發酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司；PAS7000型生物尾氣分析儀：重慶哈特曼科技有限公司；TDL-60B型飛鴿牌系列離心機：上海安亭科學儀器廠制造；SP-754型紫外可見光分光光度計：上海天普分析儀器有限公司；04711-45型超聲波破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；SPX-150生化培養箱：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵培養方法

一級種子培養：將斜面菌樣接入裝料量為25 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，制備2瓶，于30 ℃、180 r/min搖床培養12 h。

二級種子培養：將6 mL一級種子液接入裝料量為600 mL液體培養基的5 L三角瓶中，于30 ℃、180 r/min搖床培養12 h。

分批發酵培養：發酵罐滅菌前加入15 mL消泡油，調節pH值為7，滅菌后將600 mL二級種子液接入裝有30 L液體培養基的50 L發酵罐中，于30 ℃、200～480 r/min（溶氧轉速聯動）、0.035 MPa條件下發酵培養，當菌體量OD600nm值為2時，一次性加入配制好的0.1 g/mL的L-阿拉伯糖溶液300 mL。

氨芐流加培養：其他培養條件及誘導條件同分批發酵培養，在加入誘導劑的同時，一次性加入100 mg/L的氨芐30 mL。

1.3.2 測定指標

罐上在線數據：pH、溫度、攪拌轉速、耗氧速率（oxygen consumption rate，OUR）、二氧化碳釋放速率（carbon-dioxide evolution rate，CER）、呼吸商（respiratory quotient，RQ）、溶解氧（dissolved oxygen，DO）等。

發酵過程中每2 h測一次OD600nm、氨基酸態氮和乙酸含量，每4 h測一次酮基還原酶酶活?；罹鷶岛唾|粒穩定性的取樣點由細胞生長周期數據需求進行選擇。菌體量測定：發酵液用蒸餾水稀釋適當的倍數，振蕩混合搖勻后，用紫外可見光分光光度計測定波長600 nm處的光密度值（OD600nm）。采用國際酶學委員會規定的定義酶活：40 ℃，pH值為6.0條件下，每分鐘消耗1 μmol NADPH所需要的酶量為1個酶活單位（U/L）?；罹鷶禍y定：采用稀釋涂布平板法，將發酵液進行適當的梯度稀釋，分別涂布到瓊脂平板表面，37 ℃培養24 h后檢查平板上菌落形成單位（colony forming unit，CFU）數量。酮基還原酶酶活測定方法見參考文獻[8]。發酵液氨基酸態氮測定：甲醛滴定法，見參照文獻[9]。發酵液乙酸含量測定：測定方法見參考文獻[10]。質粒穩定性測定：平行平板法，見參照文獻[11]。

2 結果與分析

2.1 重組大腸桿菌KR-C在50 L發酵罐中生長規律研究

2.1.1 發酵過程中在線測定參數的變化

探索了50 L發酵罐的重組大腸桿菌KR-C的生長規律，發酵過程的在線參數檢測結果見圖1。

圖1 發酵過程在線參數的變化趨勢Fig.1 Trends of real-time parameters in the fermentation process

由圖1CER與OUR曲線分析可知，菌體在0～4 h呼吸強度較弱，4～8 h呼吸強度呈指數增長，8～10 h CER與OUR達到最大值后趨于穩定，10～12 h呼吸強度經過急劇下降后出現了二次增長現象，此時溶氧也出現了短暫的回落，13 h后呼吸強度又一次急劇下降后一直處于較低的水平；從pH 曲線分析可知，發酵液的pH值在前6 h幾乎穩定不變，6～10 h后pH值逐漸下降，10～12 h pH值回升達到最大，12 h后pH值幾乎保持恒定。

2.1.2 發酵過程中氨基酸態氮、乙酸及酶活的變化

發酵過程中氨基酸態氮、乙酸及酶活的變化結果見圖2。

圖2 發酵液中氨基酸態氮、乙酸及酶活隨發酵時間的變化趨勢Fig.2 Changing trends of amino acid nitrogen,acetic acid concentration and enzyme activity of fermentation broth with time

由圖2可知，發酵液中氨基酸態氮含量在前4 h變化并不明顯，4～12 h 急劇下降，12～18 h緩慢上升后達到最低并趨于穩定；乙酸在前6 h增長緩慢，6～10 h快速上升，10～12 h又迅速下降，12 h后趨于穩定；酮基還原酶的酶活在12 h達到最大，12 h后酶活迅速下降。

2.1.3 發酵過程中OD600nm、活菌數及質粒穩定性的變化

圖3 發酵過程中重組大腸桿菌菌體的累積量(OD600nm)、活菌數以及質粒穩定性隨時間的變化趨勢Fig.3 Changing trends of the cumulative amount of the recombinant Escherichia coli (OD600nm),viable cells number and plasmid stability with time during fermentation

由圖3可知，重組大腸桿菌菌體的累積量（OD600nm）在0～4 h增長緩慢，4～12 h 呈指數增長，12 h后趨于穩定；而活菌數在前10 h的變化趨勢與OD600nm相似，在10 h達到最大值，但10～20 h期間發酵液中的活菌數逐漸下降，20 h活菌數下降速度加快；帶質粒的重組大腸桿菌在前10 h幾乎達到100%，10～20 h期間質粒穩定逐漸降低，20 h后，質粒丟失速度加快，發酵結束后，帶質粒的菌體僅占所有菌體的83%。

2.1.4 質粒穩定性

發酵22 h后質粒穩定性檢測結果見圖4。

圖4 發酵22 h后質粒穩定性檢測結果Fig.4 Determination results of plasmid stability after fermentation for 22 h

由圖4可知，在平皿上編號為2、17、20、24、31、33、48、50、57、66、84、88、86、91、95、96、97這17個區域內加有氨芐的A平板里面沒有出現菌落，而沒有加氨芐的B平板里面長了菌落，由此證實大約有17%的活菌的質粒在此時已經丟失了。

2.1.5 重組大腸桿菌KR-C在發酵過程的變化

重組大腸桿菌KR-C在發酵過程的生長規律如下：

（1）在發酵前期（0～4 h）為延滯期，此期間為菌體的適應期，表現為菌體生長速度較慢，總呼吸強度弱，碳源與氮源消耗速率低，pH值幾乎不變化，乙酸積累量不高；

（2）4～8 h為對數增長期，菌體適應新環境后，活菌數、菌體累積量開始急劇增長，導致攝氧率以及呼出CO2增多，與此同時碳源被大量消耗，代謝副產物乙酸逐漸積累，pH逐漸降低，此過程菌體的累積為后續酮基還原酶的大量表達奠定了基礎；

（3）8～10 h為穩定期，圖1中CER與OUR曲線分析可知此階段菌體的總呼吸強度幾乎不變，值得注意的是，此階段（圖3）菌體的累積量、活菌數仍不斷升高?？赡苁乔捌诰w的大量累積導致菌體生長環境中的能源以及溶氧的過度消耗，致使部分菌體提前進入呼吸衰弱期，而新增長的菌體彌補了這部分呼吸強度值，但是在檢測OD600nm值時并不能表現出來。8 h的活菌數明顯低10 h，可能原因是對數生長期的細胞容易形成細胞鏈[12]，普通搖勻振蕩很難有效分散成單個細胞，使得平板活菌計數中很多菌落由多細胞群體形成，從而導致測量的活菌數低于實際值。

（4）10～12 h為二次增長期，CER與OUR經過短暫的急劇下降后出現了二次增長現象，與此同時，乙酸的積累量從急劇下降，pH值回升，說明乙酸作為碳源再次被消耗導致了二次增長現象。這階段雖然OD600nm值雖然有緩慢的增長趨勢，但是活菌數開始下降。同樣，此階段為產酶積累期，酶活在12 h達到最高，說明該酶的表達與菌體量的增長部分關聯，酶的大量積累需要一定數量的菌體累積作為前提。

（5）12 h后為衰亡期，由圖3可知，活菌數逐漸下降，進入衰亡期的菌體增多。在發酵結束時，雖然活菌數比對數初期（4 h）高，但呼吸強度卻遠低于對數初期，說明此時大部分菌體處于死亡或者瀕臨死亡狀態。在此階段酶活逐漸降低，到發酵20 h后酶活僅為17.78 U/mL。原因可能是，一方面質粒穩定性逐漸下降，說明在發酵后期，即使菌體仍然存在活性，但是質粒逐漸丟失，因此產能降低；另一方面發酵營養條件的缺乏和有害代謝物的積累，可能激發細胞產生了比較劇烈的熱激反應，由此產生的熱激蛋白會增強胞內蛋白水解酶的活力[13]。

2.2 菌體生長與產酶的關聯性研究

重組大腸桿菌培養過程中通常采用增加“選擇壓力”來提高重組大腸桿菌質粒的穩定性。史悅等[14]發現質粒PETNHM在無抗生素選擇壓力下，連續傳代48代后質粒開始丟失，進一步研究表明，卡拉霉素的選擇壓力下能夠保證質粒的穩定遺傳。發酵過程中質粒的丟失可能會使重組大腸桿菌不再是優勢菌，取而代之的是不帶質粒的普通大腸桿菌。從前期實驗可知，在發酵過程中重組大腸桿菌的質粒在4 h開始丟失，因此本實驗設計為對照組罐1：不流加氨芐；實驗組罐2當發酵4 h時，向發酵罐中流加氨芐溶液，并使發酵液中氨芐的終質量濃度為100 mg/L。發酵過程中，定時取樣檢測比生長速率、OD600nm、活菌數、氨基酸態氮、乙酸、酶活以及質粒穩定性。實驗結果見圖5。

圖5 兩組實驗檢測比生長速率及OD600nm(A)、活菌數及質粒穩定性(B)、氨基酸態氮及乙酸含量(C)、酶活(D)結果對比Fig.5 Comparison results of specific growth rate and OD600nm(A),viable count and plasmid stablity (B),amino nitrogen and acetic acid contents (C) and enzyme activity (D) of the two experiments

由圖5A可知，從OD曲線看雖然實驗組的菌體最大累積量略大于對照組，但是除2～6 h時間段外大部分時間段內實驗組比生長速率低于對照組；由圖5B可知，實驗組活細菌數到達最大值的時間為12 h，而對照組為10 h，雖然實驗組在10 h活菌數比對照組稍低，但在10～12 h后趕超。實驗組在發酵結束后仍有97%的菌體帶有質粒；由圖5C可知，實驗組中氨基酸態氮的利用比對照組多，而在最大乙酸積累時期，實驗組積累的乙酸低于對照組；由圖5D可知，實驗組最大酶活（125.9 U/mL）高于對照組（92.2 U/mL），兩者出現的最高點均為12 h，從酶活曲線來看，酶活大量表達的時期為10～12 h。

結合上述現象可知，加入氨芐會使帶有質粒的菌成為優勢菌，這對于酮基還原酶的表達有一定的影響。首先，實驗組的比生長速率低于對照組，說明帶有質粒的菌體傳代速率慢，而不帶質粒的菌體傳代速率快，表明質粒增加了菌體的代謝負荷。其次，在10～12 h內實驗組活菌數高于對照組，相應時間段發酵液中的代謝產物酮基還原酶的酶活也高于對照組，由此可說明外源蛋白的表達量依賴于帶有質粒的活菌的數量，帶有質粒的活菌數越高，酶活越高。另外，8～10 h，實驗組積累的乙酸以及比生長速率低于對照組，由于乙酸的積累不僅會限制菌體的生長[15]，而且會抑制產物的合成[16]，而減小對數生長期的比生長速率可以減少乙酸的積累[17]，帶有質粒的菌體傳代速度較小，降低了比生長速率，同時也減少了乙酸的積累，進而使酮基還原酶的表達量增加。

與搖瓶實驗相比，在50 L發酵罐中，菌體最大累積量遠大于搖瓶，但酶活的表達量（無論有無添加氨芐）并沒有達到理想的水平?？赡苡捎趽u瓶發酵條件的控制與罐上發酵條件存在著巨大差異，使得放大過程中存在“放大效應”[18]。此外，KR在大腸桿菌中的可溶性差[19]，發酵過程極易產生包涵體，包涵體形式的KR需要變性復性的過程才能顯示活性，因此也可能因為發酵罐中KR基因的表達過快而導致蛋白沒有正確的折疊而產生包涵體，使酶活低于搖瓶發酵的產量。

3 結論

結果表明，重組大腸桿菌KR-C在50 L發酵罐中生長過程分為4個階段：延滯期（0～4 h），為菌體的適應期；對數生長期（4～8 h），為菌體量積累期；穩定期（8～10 h），為酶的表達前期，乙酸積累期，二次增長期（10～12 h），為酶大量積累期，乙酸消耗期；衰亡期（12 h 后），為菌體衰亡，酶被降解期。

另外，重組大腸桿菌KR-C發酵中的一些問題也值得關注：（1）碳源的缺乏是發酵中期導致菌體提前進入衰亡期的關鍵因素，也是導致酮基還原酶表達時間縮短的關鍵因素；（2）酮基還原酶的大量表達要以大量的活菌數和生長環境中較低的乙酸含量為基礎；（3）對數生長期的比生長速率對酮基還原酶表達有很大的影響，將比生長速率控制在0.3 h-1以下有利于酶活的提高；（4）在發酵后期，營養物缺乏可能導致胞內蛋白酶被激活，致使酶活迅速降低。

通過對重組大腸桿菌KR-C在50 L發酵罐中生產酮基還原酶的特性研究，摸索了其發酵的基本規律，為以后進一步放大生產研究奠定了基礎，同時也為酮基還原酶的后續研究指明了方向。

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