一株高寒地區產纖維酶細菌的篩選、鑒定及酶學性質研究

金朝暉，陳 瓊，趙樹楠，林 凌*

（安徽師范大學 生命科學學院，安徽 蕪湖 241000）

纖維素酶是指能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶，為起協同作用的多組分酶系[1]，其應用范圍涉及醫藥、紡織、日用化工、造紙、食品發酵、工業洗滌、煙草、石油開采、廢水處理及飼料等各個領域。在釀造行業中，纖維素酶能夠起到提高酒類產品的出酒率，改善酒的品質，增加果酒口感的作用；同時也能夠提高醬油、食醋的產量，增加調味品的風味[2]。此外，纖維素酶在廢棄生物質能源利用開發方面，具有巨大的潛在價值。合理有效地利用與轉化地球上的纖維素原料，對于解決工農業環境污染、當今石油能源危機具有重要現實意義[3]。相對于最適催化溫度為50～60 ℃的中溫型纖維素酶，適冷型纖維素酶能夠在自然條件（10～30 ℃）維持較高的酶活力和催化效率，大大縮短處理過程的時間并節省昂貴的加熱或冷卻費用[4]。因此研究與發掘適冷型纖維素酶，能夠有效地減少工藝流程并降低生產成本[5-7]。

實驗樣品取自青海高寒地區，利用其獨特的低溫環境篩選出所需要的具有適冷型纖維素酶的目的菌株[6]，為纖維素酶的發掘與利用提供了一定的研究思路與基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

實驗土壤樣品采集自青海茶卡鹽湖地區，取樣坐標為東經99°02′，北緯36°45′。

1.1.2 試劑

剛果紅染色液：稱取剛果紅粉末溶解于蒸餾水中，終質量濃度為1 g/L。

剛果紅脫色液：終濃度為1 mol/L 的NaCl 溶液。

3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）顯色劑：分別稱取NaOH 104 g、3,5-二硝基水楊酸30 g、純酒石酸鉀鈉910 g、重蒸苯酚25 g和無水亞硫酸鈉25 g溶于2 500 mL蒸餾水，貯存于棕色瓶中避光保存，放置一星期后過濾使用。

5 g/L羧甲基纖維素鈉（carboxymethylated cellulose-Na，CMC-Na）溶液：準確稱取0.50 g 羧甲基纖維素鈉用pH 8.0磷酸緩沖液溶解并定容至100 mL。

1.1.3 培養基

纖維素富集培養基（1 L）：MgSO40.1 g，CaCl20.1 g，（NH4）2SO42.0 g，K2HPO42.0 g，KH2PO40.5 g，NaCl 6 g，瓊脂1.5%，CMC-Na 0.5%，pH值調節至7.0。

纖維素篩選培養基（1 L）：在上述纖維素酶富集培養基中加入酵母粉1 g。

發酵液體培養基（1 L）：酵母粉5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，纖維素0.1%，pH調節至7.4。

1.2 儀器與設備

iCycler型PCR儀：美國伯樂公司；SKY2102C型恒溫搖床：上海蘇坤實業有限公司；UV-1700型紫外分光光度儀：日本島津公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；5415D型臺式高速離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產纖維素酶菌株初篩

稱取土壤樣品1 g，添加到100 mL無菌水中充分混勻，然后按10倍稀釋法依次添加無菌水稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6的菌懸液。取10-4、10-5、10-63個稀釋度的菌懸液各0.1 mL涂布于纖維素富集培養基平板上，置入28 ℃恒溫培養箱中倒置培養。

1.3.2 產纖維素酶菌株復篩

挑取單一菌落接種于纖維素篩選培養基上，置入28 ℃恒溫培養箱中倒置培養。待長出菌落后，向培養皿中加入剛果紅染液染色10 min，倒去染液，再加入脫色液浸泡5 min進行脫色處理，依據透明圈直徑和菌落直徑比值的大小篩選高產纖維素酶菌株[8]。

1.3.3 粗酶液的制備

將分離得到的菌落接種于25 mL液體發酵培養基中，于28 ℃、180 r/min搖床中進行搖瓶發酵90 h；將所得發酵液進行4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集上清液作為粗酶液，用于測定纖維素酶的活力。

1.3.4 纖維素酶酶活力測定

參照穆春雷等[9]所述的方法，并加以適當修改，測定樣品的纖維素酶酶活力。

以50 mL 5 g/L CMC-Na（pH 8.0的磷酸緩沖液配制）為底物，加入50 mL酶液，35 ℃水浴反應30 min后，加入100 mL DNS顯色液，沸水浴煮5 min，取出后在流水下迅速冷卻后定容至1 mL搖勻，在波長540 nm處測定吸光度值。在此實驗條件下，1 mL酶液每分鐘產生1 μmol還原糖的酶量作為1個酶活單位，用U/mL表示。

1.3.5 細菌的分子鑒定

以TIANGEN基因組純化試劑盒提取待測菌株基因組DNA，用16S rDNA 通用引物進行PCR擴增，反應體系：1 μL模板DNA，引物27 F（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）和1492 R（5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）各0.5 μL，4 μL dNTP、5 μL 10×PCR Buffer，3 μL Mg2+，0.5 μL rTaq，35.5 μL雙蒸水。

PCR反應程序：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，32個循環后，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。產物送至南京金斯瑞生物技術公司進行序列測定，并通過Genbank核酸數據庫進行同源比對分析，確定待測菌株分類地位。

1.3.6 搖瓶產酶研究

將菌種接種于50 mL pH 8.0的產酶發酵培養基中，置于25 ℃、180 r/min 搖床培養4 d，按時測量液體培養基中菌株的OD600nm值并按DNS法[10-11]測定其酶活力。

1.3.7 酶學性質研究

酶的最適溫度測定是按照酶活測定方法，取適當稀釋的酶液分別在20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃條件下測定相對酶活（%）。酶的熱穩定性測定是將酶液在以上不同溫度條件下保溫1 h，迅速冷卻后，參照1.3.4酶活測定方法測定殘余酶活力（%）。

酶的最適pH值測定是按照酶活測定方法，以不同緩沖液（pH值3.0～5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH值5.5～8.0的磷酸鹽緩沖液，pH值8.5～11.0為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液）校準發酵液的pH值，在酶反應的最適溫度條件下測定酶活性，以最高酶活為100%，參照1.3.4酶活測定方法計算各反應體系相對酶活。

酶促進劑與抑制劑研究是在相同條件下，向酶液中分別加入不同的離子，包括Li2+、K+、Rb2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Ni2+、Mn2+、Co2+、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS)、（NH4）Cl和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），使其終濃度為0.1 mmol/L，同時以未處理的酶液作為100%對照，在酶反應的最適pH值和最適溫度的條件下測定各離子對酶活力的影響，以殘余酶活（%）表示。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

從青海茶卡鹽湖地區土壤中所分離的菌株，其菌落形態如圖1所示，菌落呈淡黃色、圓形、凸起、表面光滑、邊緣整齊。菌株水解圈如圖2所示，菌株在纖維素篩選培養基上形成明顯的透明水解圈，說明其具有良好的降解纖維素能力。根據形態特征，結合16S rDNA序列分析數據，將該菌株歸為青海瓊斯氏菌屬（Jonesia quinghaiensissp.）[12]。

圖1 菌株的菌落形態Fig.1 The colony morphology of strains

圖2 篩選菌株的水解圈大小Fig.2 The hydrolyzation circle of screened strains

2.2 菌株的搖瓶產酶試驗

對所分離菌種進行生長曲線繪制，并測定發酵過程中的纖維素酶活力，結果如圖3所示。

圖3 菌株的發酵產酶曲線Fig.3 Enzyme production curve of strain

由圖3可知，該菌的各個生長階段比較明顯。菌體生長的延滯時間較短，13 h后逐步進入生長對數期；培養50 h后，菌體生長達到穩定期，并于70 h后開始進入衰退期。相對酶活曲線顯示，產酶量與細菌生長基本保持同步，二者的關系表現為耦聯型，即伴隨菌體快速生長纖維素酶呈積累式增長，菌體生長近穩定期時，纖維素酶酶活力達最大值，為0.3 U/mL。

2.3 菌株酶學性質研究

2.3.1 酶的最適溫度與熱穩定性

圖4 反應溫度對相對酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on relative enzyme activity

在不同反應溫度中分別測定酶液的相對酶活，結果如圖4所示。

由圖4可知，當反應溫度處于25～45 ℃時，酶活性表現出較高水平，能維持50%以上的酶活力，其最適反應溫度為35 ℃，酶活力達到0.25 U/mL，具有常溫催化水解纖維素的能力。

將酶液置于在不同反應溫度中保溫1 h，迅速冷卻后測定方法測定其殘余酶活，結果如圖5所示。

圖5 溫度對酶穩定性的影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme stability

由圖5可知，該酶在45 ℃時具有一定的耐受性，保溫1 h仍具有60%以上的活力，而超過50 ℃酶活力迅速下降，僅維持原酶活的20%左右。

2.3.2 酶的最適pH值

在不同pH值緩沖溶液中分別測定酶液的相對酶活，結果如圖6所示。

圖6 pH值對相對酶活的影響Fig.6 Effect of pH on relative enzyme activity

由圖6所示，該酶的最適反應pH值為8.0，在pH值6.0～10.0的范圍內具有較高的活性，pH值范圍較廣泛。

2.3.3 酶促進劑與抑制劑研究

在pH值8.0和最適溫度35 ℃的條件下測定各離子對酶活力的影響，結果見圖7。

由圖7可知，金屬離子Ca2+、Zn2+對該酶有較強的促進作用，均在150%以上；Ni2+、K+、Li+、Rb2+對酶也有不同程度的促進作用；而Mn2+、Cu2+、Co2+對酶活力有較強的抑制作用，其余離子對酶的影響不明顯。

圖7 不同離子對相對酶活的影響Fig.7 Effect of different ions on relative enzyme activity

3 結論

本研究以纖維素為唯一碳源的選擇性培養基進行富集，從青海省茶卡鹽湖湖灘土壤中分離得到一株產纖維素酶菌株。經形態觀察結合16S rDNA序列測定發現，該菌株歸屬于青海瓊斯氏菌屬（Jonesia quinghaiensissp.）[13-14]。

搖瓶產酶試驗表明，該菌株在接種后45 h達到生長穩定期，酶活伴隨著菌體生長不斷上升，在45 h時達到最高值，此時酶活力為0.3 U/mL。酶學性質的初步研究顯示，該菌株產生纖維素酶的最適反應pH為8.0，在pH 8.0～9.0之間都能保持較高的酶活；最適反應溫度為35 ℃，對50 ℃以上的高溫較為敏感。二價金屬離子Ca2+、Zn2+對該酶有明顯的促進作用，Mn2+、Cu2+、Co2+對酶活力有較強的抑制作用。

纖維素酶分解菌所產生的酶有很多重要的應用價值，但酶促反應溫度水平偏高，多處于50～60 ℃之間，在工業應用中需要耗時、耗能進行加熱或冷卻處理[4，15]。該酶具有較高的離子耐受性，催化反應溫度接近于酵母生長發酵溫度（30 ℃），適用于同步糖化發酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）工藝的開發和利用研究。因而，該產酶菌株具有良好的開發應用前景，對該酶進行深入而細致的研究，是尋找和提升生物工業領域技術的重要手段，也將為研究開發節能、高效的工業用酶奠定理論基礎。

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