綠色木霉與黑曲霉混合發酵產纖維素酶的研究

姜伯玲，王曙陽 *，李文建，董妙音，陳積紅，劉 敬，胡 偉

（1. 中國科學院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學院大學，北京 100049）

纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協同作用，分解纖維素產生寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖[1-2]。一般按照其催化功能可分為3大類：外切-β-1,4-葡聚糖酶（exo-l,4-β-D-glucanase，CBH）E.C.3.2.1.4、內切-β-1,4-葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanase，EG）E.C.3.2.1.91及β-葡萄糖苷酶（β-D-1,4-glucosidase，β-GA）E.C.3.2.1.21。天然纖維的組成和結構不同，3種酶必須同時參與才能將纖維素晶體降解為簡單糖類[3-5]。

目前，纖維素酶在食品、紡織、畜牧業、醫藥工業、生物質能源開發及工農業廢棄物回收等方面已廣泛應用[6-8]，市場對纖維素酶的需求量日益增加。能分泌纖維素酶的微生物是纖維素酶的主要來源，主要有真菌、細菌、放線菌和一些原生動物等[9-10]。真菌類的木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）能產生3類纖維素酶且是胞外酶，降解纖維素的能力較強，因此是人們研究纖維素酶的熱點領域。但應用研究發現，單菌發酵所產的纖維素酶存在酶系不完整和個別酶活低的缺陷，如綠色木霉及其近緣菌株發酵產內切葡聚糖酶活力較高，但所產的纖維素酶中普遍存在β-葡萄糖苷酶（β-GA）活力低的缺陷，而黑曲霉產β-葡萄糖苷酶能力較高，產內切和外切葡聚糖酶能力較低[11-13]。纖維素酶活高低是影響纖維素酶降解纖維素能力的一個重要指標，而纖維素酶系組分配比的合理性也是不可忽視的一個影響因素。DUFF S J B等[14-15]報道，β-GA與濾紙酶活力（filter paper activity，FPA）的比值在0.12～1.50范圍內時，纖維素酶系完整，組分配比合理，可以有效降解天然纖維素。因此，開發產纖維素酶活高、酶系全、酶組分配比合理的多菌混合發酵在降低纖維素酶生產成本、提高纖維素酶降解能力等方面有重要意義[16]。

本研究利用綠色木霉與黑曲霉混合發酵生產纖維素酶，研究了綠色木霉與黑曲霉單獨發酵及混合發酵產纖維素酶酶活的特點，優化黑曲霉的接種時間及混合發酵時間，使混合發酵所產纖維素酶系完整、降解纖維素能力增強，從而降低生產成本，利于工業生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

綠色木霉（Trichoderma viride）GSTCC 62010（NM01）、黑曲霉（Aspergillus niger）GSTCC 60108（NH01）：甘肅省微生物菌種保藏中心；綠色木霉NMy及黑曲霉NHy由綠色木霉NM01、黑曲霉NH01混合發酵選育得到；黑曲霉NH11-1是黑曲霉NH01通過重離子輻照選育得到；選育得到的菌株均保存于中國科學院近代物理研究所微生物實驗室。

1.1.2 主要試劑

羧甲基纖維素鈉（carboxymethylatedcellulose，CMC-Na）：天津市北辰方正試劑廠；微晶纖維素、水楊苷：加拿大Bio Basic股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：上海中秦化學試劑有限公司；瓊脂：北京索萊寶科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.3 培養基

（1）斜面培養基：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，蔗糖20 g，水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

（2）種子培養基：CMC-Na 7.5 g，蛋白胨5.0 g，吐溫-80 2.0 mL，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，ZnSO4·7H2O 0.001 4 g，CoCl20.002 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

（3）發酵培養基：CMC-Na 7.5 g，吐溫-80 2.0 mL，（NH4）2SO41.4g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O0.3g，CaCl20.3 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，ZnSO4·7H2O 0.001 4 g，CoCl20.002 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

SP-756PC型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；HZQ-X300型恒溫振蕩器、DHP-9082型電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機：湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠色木霉和黑曲霉單獨發酵培養方法

將4 ℃冰箱保存的綠色木霉NM01、NMy與黑曲霉NHy、NH11-1分別接種于新鮮的斜面培養基上，30 ℃恒溫培養3 d，用無菌生理鹽水洗下斜面孢子，利用血球計數板計數，控制孢子濃度為1×107個/mL，接種孢子懸液于種子培養基，30 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養12 h。將種子培養基按5%的接種量接種至發酵培養基，30 ℃、200 r/min振蕩培養5 d，取發酵液待測。

1.3.2 綠色木霉與黑曲霉混合發酵培養方法

將1.3.1中的種子培養基按綠色木霉NM01∶黑曲霉（NHy、NH11-1）=5∶1（V/V）的接種比例接種于發酵培養基，使綠色木霉NM01分別與黑曲霉NHy、NH11-1進行混合發酵，30 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養5 d，取發酵液待測。

1.3.3 混合發酵中黑曲霉NH11-1接種時間的優化

將1.3.1中的綠色木霉NM01種子培養基按5%的接種量接種至發酵培養基，黑曲霉NH11-1種子培養基分別推遲24 h、48 h、72 h接種至綠色木霉NM01發酵培養基中，綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1的接種比例仍為5∶1（V/V），30 ℃、200 r/min振蕩培養5 d，取發酵液待測。

1.3.4 纖維素酶活力和β-GA的測定

發酵液在20 ℃、4 000 r/min下離心10 min，取上清液即得粗酶液。FPA與β-GA的測定見參考文獻[17]。一個濾紙酶活力和一個β-葡萄糖苷酶活力單位均定義為：在標準反應條件下每分鐘生成1 μg葡萄糖所需的酶量（U/mL）。

1.3.5 總還原糖含量的測定

還原糖含量采用DNS方法進行測定，1.3.4中得到的粗酶液與相應底物反應后，添加3 mL DNS溶液，沸水浴中反應5 min，冷卻至室溫后，于波長520 nm處檢測其吸光度值，根據葡萄糖標準曲線回歸方程計算還原糖含量。

2 結果與分析

2.1 綠色木霉、黑曲霉單獨發酵培養對產纖維素酶活的影響

綠色木霉NM01、NMy及黑曲霉NH11-1、NHy單獨發酵5 d時，取樣進行FPA與β-GA的檢測，結果如圖1所示。

由圖1可知，綠色木霉NM01的FPA（204.60 U/mL）極顯著（P＜0.01）高于其他3個菌株；而黑曲霉NH11-1及NHy的β-GA分別為339.38 U/mL、333.67 U/mL，極顯著（P＜0.01）高于2株綠色木霉，而黑曲霉NH11-1的β-GA（339.38 U/mL）與NHy1的β-GA（333.67 U/mL）之間沒有顯著差異，這符合黑曲霉產纖維素酶的特點，即黑曲霉產β-葡萄糖苷酶的能力較強，但是產外切葡聚糖酶的能力較弱，致使纖維素酶的總體酶活不高；而綠色木霉存在β-葡萄糖苷酶酶活較低的缺陷，使得其所產的纖維素酶酶系結構不合理。此結果可作為混合發酵產纖維素酶的依據，即將FPA較高的綠色木霉NM01分別與β-GA較高的黑曲霉NH11-1及NHy進行混合發酵。

圖1 綠色木霉、黑曲霉發酵培養對產纖維素酶酶活的影響Fig.1 Effect of fermentation by Aspergillus niger and Trichoderma viride on cellulase activities

2.2 菌株混合發酵培養對產纖維素酶酶活的影響

綠色木霉NM01分別與黑曲霉NH11-1、NHy混合（5∶1）發酵培養對產纖維素酶酶活的影響結果如圖2所示。

圖2 兩菌株混合發酵培養對產纖維素酶酶活的影響Fig.2 Effect of mixed-culture fermentation by Aspergillus niger and Trichoderma viride on cellulase activities

由圖2可知，綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1混合發酵的FPA與β-GA分別為239.59 U/mL和512.88 U/mL，2種酶活極顯著（P＜0.01）高于綠色木霉NM01與黑曲霉NHy混合發酵的FPA與β-GA相應酶活（65.82 U/mL，130.06 U/mL）。與綠色木霉NM01、黑曲霉NH11-1及NHy單獨發酵相比混合發酵產β-GA效果具有明顯優勢，而所產的FPA沒有明顯提高。綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1混合發酵所產纖維素酶中β-GA與FPA的比值為2.14，超出0.12～1.50的范圍，所以需要對黑曲霉NH11-1的接種時間進行優化，控制其所產纖維素酶活的大小，從而使β-GA與FPA的比值在0.12～1.50范圍內。

2.3 混合發酵中黑曲霉NH11-1接種時間的優化

β-GA與FPA的比值在0.12～1.50范圍內時，纖維素酶水解纖維素的能力較強，而且針對不同的底物有最適的比值。從理論上來講，β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖，從而減弱纖維二糖對酶解過程的抑制，提高酶解效率，所以在范圍內其比值較大時酶解效果較好。黑曲霉NH11-1延遲接種時間對產纖維素酶酶活的影響結果見表1。

表1 黑曲霉NH11-1延遲接種時間對產纖維素酶酶活的影響Table 1 Effect of delayed inoculation time of Aspergillus niger NH11-1 on cellulase activities

由表1可知，以綠色木霉NM01和黑曲霉NH11-1單獨發酵作為對照，當黑曲霉NH11-1與綠色木霉NM01混合接入培養基時，所得到的β-GA均明顯高于綠色木霉NM01和黑曲霉NH11-1單獨發酵所得到β-GA（153.19 U/mL、339.38 U/mL），但所得到的FPA沒有明顯高于綠色木霉NM01單獨發酵所得到的FPA（204.60 U/mL）。說明黑曲霉NH11-1與綠色木霉NM01混合接種進行發酵時以黑曲霉NH11-1產β-葡萄糖苷酶為主，以綠色木霉NM01產纖維素酶為輔，而且β-GA與FPA的比值為2.14，超出0.12～1.50的范圍，即此時纖維素酶對天然纖維素的降解能力不是很強。

黑曲霉NH11-1推遲24 h接種后發酵第5天的FPA最低（101.61U/mL），β-GA與FPA的比值為2.86，即黑曲霉NH11-1與綠色木霉NM01之間未形成協同作用，而是成了綠色木霉NM01產纖維素酶的干擾因素。黑曲霉NH11-1推遲72 h接種的β-GA與FPA的比值為1.51，說明以黑曲霉NH11-1產β-GA為主，其β-GA與FPA的比值與推遲24 h接種的混合發酵組均超出0.12～1.50的范圍，即纖維素酶系不滿足水解纖維素的最佳條件。

黑曲霉NH11-1推遲48 h接種后發酵第5天的β-GA與FPA的比值為1.22，表明纖維素酶系完整，纖維素酶各組分配比合理，且FPA和β-GA較高，滿足其對纖維素進行完全水解的條件，說明此過程以綠色木霉產纖維素酶為主，而黑曲霉NH11-1起輔助協同作用。此結果不同于高星星等的報道[18]，即黑曲霉推遲接種48 h與里氏木霉混合發酵產酶效果最佳，可能與所使用菌種、培養基碳源等條件有關。

2.4 發酵時間對混合發酵產纖維素酶酶活的影響

黑曲霉NH11-1推遲48 h接種與綠色木霉NM01混合發酵時間對產纖維素酶酶活的影響結果如圖3所示。

圖3 發酵時間對混合發酵產纖維素酶酶活的影響Fig.3 Effect of mixed-culture fermentation time on cellulase activity

由圖3可知，在混合發酵第2～4天，FPA顯著下降，β-GA呈上升趨勢，說明黑曲霉NH11-1接種至綠色木霉NM01發酵瓶中后在初始階段迅速生長，在發酵體系中以黑曲霉NH11-1產β-GA為主，綠色木霉NM01產纖維素酶為輔。發酵第4～6天FPA開始逐漸上升，β-GA仍呈上升趨勢，說明此過程主要是綠色木霉NM01產纖維素酶，而黑曲霉NH11-1起輔助協同作用。綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1二者互利共生，綠色木霉產生大量的內切和外切葡聚糖酶，催化發酵培養基中的纖維素類底物產生大量纖維二糖，纖維二糖進一步誘導黑曲霉NH11-1生成大量β-GA，有效降解纖維二糖生成葡萄糖，供給綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1利用。在發酵第5天與第6天β-GA與FPA的比值分別為1.22、1.10，說明纖維素酶組分配比合理，同時纖維素酶活均較高，均滿足降解纖維素的條件，但考慮到發酵的經濟性，因此，選取發酵周期為5 d。

3 結論

與綠色木霉、黑曲霉單一培養相比，黑曲霉NH11-1與綠色木霉NM01混合發酵在產纖維素酶方面具有明顯優勢，二者可以兼容并發揮協同作用，改善纖維素酶的組分配比，并提高纖維素酶總體酶活。結果表明，黑曲霉NH11-1推遲48 h接種至綠色木霉NM01發酵瓶中進行混合發酵的產酶效果最佳，30 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養5 d，FPA達到242.80 U/mL，是出發菌黑曲霉NH11-1的2.66倍；β-GA達到297.35 U/mL，是出發菌綠色木霉NM01的1.94倍；β-GA與FPA的比值為1.22，符合纖維素酶水解天然纖維素的最佳比例范圍。

結果表明，綠色木霉NM01與黑曲霉NH11-1在同一發酵體系中二者可以兼容并發揮協同作用，可以改善纖維素酶的組分配比，并提高纖維素酶總體酶活，即混合發酵具有良好的大規模產纖維素酶的工業應用前景。

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