82例急性早幼粒細胞白血病形態學及免疫表型特征分析

陳 立，陳 郁，張文玲，王曉菲，張晨晰，張立文

1承德縣醫院 檢驗科，河北承德 067400；2解放軍總參謀部第61研究所 門診部，北京 100141；3解放軍總醫院 臨檢科，北京 100853

急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓細胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)中的一種特殊亞型，其發病兇險，早期死亡率高，以彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)或纖溶亢進所致嚴重出血傾向為主要特點。近年來，隨著以維甲酸、砷劑聯合蒽環類抗生素為基礎的化療藥物的廣泛應用，APL患者的長期生存率提高到了90% ~ 95%[1]。因而快速準確診斷APL對及時選擇合適的治療方案至關重要。目前其快速診斷和預后判斷主要依靠細胞形態學和細胞化學染色。流式細胞術(flow cytometry，FCM)對急性白血病診斷、分型及預后判斷具有重要的臨床意義[2-3]，本研究對82例APL患者骨髓細胞應用流式細胞術檢測，以形態學診斷分型為基礎，進一步分析其免疫表型及細胞形態學特點，為臨床明確診斷及鑒別提供重要的實驗依據。

對象和方法

1 研究對象 選取2010年8月- 2014年3月于解放軍總醫院就診的82例初診APL患者。診斷標準參照天津標準和FAB標準，其中男性54例，女性28例，中位年齡37(23 ~ 64)歲；M3a(粗顆粒)者20例，M3b(細顆粒)者57例，M3v(變異型)者5例。82例均行骨髓穿刺(bone marrow aspiration，BMA)及流式細胞術檢測。

2 主要儀器和試劑 流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司的FACSCalibur。所用單克隆抗體 (CD33、CD13、CD9、CD64、CD117、CD2、CD11b、CD16、CD19、CD15、CD4、CD56、CD34、CD3、CD7、CD10、CD14、CD20、HLA-DR)及各色同型對照均購自美國Becton Dickinson公司。

3 流式細胞分析 所有標本均行流式細胞術檢測免疫表型。無菌操作取3 ml EDTA-K3抗凝的骨髓樣品，用流式細胞儀Cell Quest軟件獲取30 000個有核細胞，對數取樣，CD45/SSC設門，檢測骨髓有核細胞各種抗原的表達率。流式細胞術檢測結果以熒光強度在＜102為陰性，102~ 103為弱陽性，

103~ 104為強陽性，以抗原表達＞20%為陽性。

4 骨髓涂片檢查 無菌操作取患者0.2 ml骨髓液，涂片，室溫晾干，運用瑞氏-吉姆薩(Wright-Giemsa’s)混合染液，染色15 min，水洗晾干后鏡檢，在涂片佳、染色良好、細胞分布均勻處，分類計數200個有核細胞，計算異常早幼粒細胞的百分比。

5 統計學處理 實驗數據采用SPSS17.0統計軟件處理，正態分布資料以±s表示，兩組間的顯著性差異比較采用獨立樣本的t檢驗或Mann-Whitney檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 骨髓細胞形態及流式細胞分群 每例標本經骨髓細胞形態學檢查，其中異常早幼粒細胞比例為50.5% ~ 94.5%，此類細胞大小不一，呈類圓或不規則形；細胞質豐富，色藍，細胞質內可見粗細不一、紫紅色顆粒及Auer小體，邊緣偽足樣突起明顯；胞核多呈不規則形，核有扭曲、凹陷、折疊及分葉；核染色質細致，核仁l ~ 3個(圖1)。進行CD45/SSC設門后將骨髓細胞分為淋巴細胞、單核細胞、粒細胞及幼稚細胞群，在APL患者中均可見一群異常細胞，這群細胞占核細胞總數的45.6% ~ 88.2%。該細胞的特點：細胞群均一、明顯，CD45弱陽性，SSC值較大(圖2)。在細胞分布及抗原表達中CD33和CD13呈強陽性表達，且CD33熒光強度均勻一致(圖3)。

圖1 APL患者骨髓細胞形態圖 2 APL患者骨髓細胞CD45/SSC散點圖P1：幼稚細胞群； P2：淋巴細胞； P3：單核細胞； P4：粒細胞Fig. 1 Bone marrow cell morphology of APL patientsFig. 2 Scatter diagram of CD45/SSC of APL patients P1: blasts; P2: lymphocytes; P3: monocytes; P4: granulocyte

圖3 82例APL患者CD13抗原和CD33抗原表達散點圖Fig. 3 Scatter diagram of CD13 and CD33 antigen expression of 82 APL cases

2 APL患者的免疫表型分析 82例APL細胞全部表達抗原CD33和CD13，其平均陽性細胞比例分別為90.2%、85.3%；CD64和CD9抗原陽性表達率也較高，分別為91.5%、85.4%。表達早期髓系抗原CD117陽性率為65.9%，表達T淋巴細胞相關抗原CD2陽性率為11.0%，17.1%的患者異常表達CD56，表達髓系成熟標志CD15抗原陽性率僅為9.8%。CD19、CD34、CD7和HLA-DR抗原陽性表達率較低，基本不表達CD16、CD4、CD3、CD10、CD14和CD20。見表1。

表1 82例APL患者免疫表型Tab. 1 Immunophenotypic characteristics of 82 APL cases

3 APL患者陽性抗原表達強度分析 根據陽性細胞比例的不同范圍，即20% ~ 40%、40% ~ 60%、60% ~ 80%和80% ~ 100%進一步分析陽性抗原表達分布，CD13、CD9、CD64、CD117、CD56在4個不同的表達強度范圍內均有分布。其中CD33和CD13主要分布在80% ~ 100%的強表達范圍內，CD9和CD64大多分布在60% ~ 80%和80% ~ 100%的表達范圍內，淋系標記CD56和CD2主要分布在20% ~ 40%和40% ~ 60%的弱表達范圍內，CD117大多分布在20% ~ 40%和60% ~ 80%的表達范圍內。而CD15、CD11b、CD19、CD7、CD34和HLA-DR大多分布在20% ~ 40%的弱表達范圍內，其平均陽性細胞比例均較低。見表2。

4 APL患者抗原比較 按白血病細胞表達CD34和HLA-DR的強度，分成CD34+和(或)HLA-DR+(包 括CD34+HLA-DR+、CD34+HLA-DR-、CD34-HLA-DR+)共27例(32.9%)以 及CD34-和HLADR-共55例(67.1%)兩組進行比較，其中抗原CD2和CD56在兩組間的表達有統計學差異(P＜0.05)，其他抗原組間比較無統計學差異(P＞0.05)。見表3。

5 M3a、M3b及M3v型中各抗原陽性表達率比較M3a型CD117抗原陽性表達率明顯高于M3v型(P＜0.05)，M3v型CD34抗原陽性表達率明顯高于M3a和M3b型(P＜0.01)，而其他抗原組間比較無統計學差異(P＞0.05)。見表4。

表2 82例APL患者的陽性抗原表達強度Tab. 2 Positive antigen expression intensity of 82 APL cases

表3 APL患者的CD34+和(或) HLA-DR+組與CD34-和HLA-DR-組比較Tab. 3 Comparison of CD34+ and/or HLA-DR+ group and CD34- and HLA-DR- group (%)

討 論

CD13、CD33是髓系特異性免疫標志，在不同類型白血病中表達率不同。Kaleem等[4]報道大部分APL細胞具有特殊的免疫特征，高表達CD13、CD33和CD9，而CD34、HLA-DR大多為陰性。本研究結果顯示，APL患者白血病細胞群均一、明顯，因其顆粒較多表現為SSC值較大，與成熟粒細胞相似；82例APL患者表現為CD33+CD13+陽性共表達，共表達率100.0%，CD33抗原的平均陽性細胞比例可達90.2%，CD13次之(85.3%)?？乖瑿D64和CD9陽性表達率及平均陽性細胞比例分別為91.5%(67.4%)、85.4%(68.2%)，表達率與文獻報道相似[5]。而抗原CD34、HLA-DR陽性表達率較低。這說明通過CD45/SSC散點圖特征及細胞高表達抗原CD13、CD33和CD9，但CD34和HLA-DR陽性表達率較低時應該考慮APL的可能性。正常情況下髓系成熟標志CD15抗原在早幼粒細胞階段即開始高表達[6]，然而與正常早幼粒細胞不同，APL患者的異常早幼粒細胞很少表達這個抗原(表達率僅為9.8%)，且表達強度也較弱。

表4 M3a、M3b及M3v型中各抗原陽性表達率比較Tab. 4 Comparison of antigen positive rate of M3a, M3b and M3v (%)

各抗原表達陽性細胞比例不盡相同，CD33抗原不但陽性率和陽性細胞比例高，且分布較一致；而CD13、CD9、CD64、CD117、CD56等抗原的陽性細胞比例分布不一致，為20% ~ 100%，這決定了初診時具有上述抗原表達的APL細胞比例高低不等。因此盡可能選用初診幼稚細胞中表達率高的抗體，使其適用范圍更廣。CD117是一種分子量為145 kU的跨膜蛋白受體，其配體為干細胞因子(stem cell factor，SCF)。SCF是重要的造血生長因子，與其他細胞因子協同作用可刺激造血干/祖細胞的增殖和分化。有文獻報道CD117在正常骨髓細胞的陽性率較低，主要在干細胞、髓系定向祖細胞上表達[7]。國內外關于APL患者中CD117陽性表達率報道多為23.0% ~ 80.0%。本研究結果顯示，CD117陽性表達率及平均陽性細胞比例分別為65.9%與56.4%。盡管CD117的陽性細胞比例有差異，但目前還沒有更好的標志可以替代CD117進行早期細胞設門。另外，對初治CD117表達不高的患者，利用CD117進行設門分析時，可能會低估白血病細胞的比例，因此在解釋結果時要加以說明。

CD34是干細胞祖細胞的標志，表達于最早的干細胞祖細胞上，隨細胞成熟其抗原表達逐漸減弱直至消失，HLA-DR表達于白血病細胞的較早分化階段，我們按照患者異常早幼粒細胞在這2種抗原的表達強度，將所有患者分為表達較為幼稚的CD34+和(或) HLA-DR+組和表達較為成熟CD34-和HLA-DR-組。結果顯示，CD34+和(或) HLA-DR+組表達CD2、CD56抗原強度明顯高 于CD34-和HLA-DR-組。Montesinos等[8]發現，APL患者異常表達CD56完全緩解的持續時間更短，5年復發率更高，總體生存期更短。國外文獻報道CD56陽性與APL復發及預后存在一定的相關性[9]。但目前臨床對于CD56陽性出現APL復發的相關機制尚不清楚，主要有以下兩種解釋：1) CD56陽性的細胞，大多都比較幼稚，帶有多能干造血干細胞性質，對以維甲酸+蒽環類為基礎的藥物缺乏敏感性[10]。2)CD56陽性患者治療過程中，往往高表達P-糖蛋白，從而更容易出現化療藥物耐藥。CD2是T淋巴細胞上分布的一種綿羊紅細胞受體，與T淋巴細胞的活化和增殖有關。有文獻報道，白血病細胞表達CD34和CD2的APL患者對ATRA的治療效果較差，早期死亡率更高，更容易復發，總體生存期和無病生存期相對較短[11]。故CD2和CD34也可作為APL預后不良指標之一。急性白血病系列混雜模型認為[12-14]，表達CD34、HLA-DR同時跨系CD2或CD56的APL患者，其白血病腫瘤干細胞可能起源于系列未確定前更為原始的造血細胞。而不表達CD2和CD56的APL細胞則可能起源于髓系已確定后較為成熟的髓系祖細胞[15-16]。因此，表達CD34、HLA-DR抗原的APL細胞更多出現跨系表達CD2和CD56。

APL形態學診斷可分為M3a型(粗顆粒)、M3b型(細顆粒)和M3v型(變異型)，M3v型是指異常早幼粒細胞胞核呈雙葉、多葉或腎形，胞質內無或少顆粒，Auer小體少見。在82例APL患者中M3b型比例最高為69.5%。我們進行免疫表型分析結果顯示，M3a型CD117抗原陽性表達率明顯高于M3v型，M3v型CD34抗原陽性表達率明顯高于M3a和M3b型。這提示M3v型患者CD34表達率高，此型APL細胞可能來源于更原始的祖細胞。據文獻報道[17-18]，M3v型患者中表達CD2陽性率高，而M3a、M3b型大多不表達CD2，推斷CD2和M3v有一定關系。本研究中82例APL患者診斷M3v型僅5例，表達CD2抗原有1例，但由于M3v型例數過少，無法證實CD2與M3v型的關系，尚需擴大樣本量進一步研究。對于常見的M3a型較易鑒別，但M3b、M3v型細胞顆粒細小，似灰塵樣，核扭曲折疊，易誤診為單核細胞，因此以骨髓細胞形態學為基礎結合免疫表型分析，有助于鑒別診斷及了解細胞的不同分化階段和類型。

1 Wang ZY， Chen Z. Acute promyelocytic leukemia： from highly fatal to highly curable［J］. Blood， 2008， 111（5）： 2505-2515.

2 徐曉蘭，范志平，宋蘭林，等.伴t（11；17）（q23；q21）易位的急性早幼粒細胞白血病1例并文獻復習［J］.南方醫科大學學報，2007，27（6）：923-924.

3 常曉麗，董征，劉莎，等.伴t（11；17）（q23；q21）易位的急性早幼粒細胞白血病1例并文獻復習［J］.解放軍醫學雜志，2013，38（5）：378-382.

4 Kaleem Z， Crawford E， Pathan MH， et al. Flow cytometric analysis of acute leukemias. Diagnostic utility and critical analysis of data［J］. Arch Pathol Lab Med， 2003， 127（1）： 42-48.

5 Paietta E. Expression of cell-surface antigens in acute promyelocytic leukaemia［J］. Best Pract Res Clin Haematol， 2003， 16（3）：369-385.

6 王建中.臨床流式細胞分析［M］.上海：上?？茖W技術出版社，2005：287-288.

7 Rizzatti EG， Garcia AB， Portieres FL， et al. Expression of CD117 and CD11b in bone marrow can differentiate acute promyelocytic leukemia from recovering benign myeloid proliferation［J］. Am J Clin Pathol， 2002， 118（1）： 31-37.

8 Montesinos P， Rayón C， Vellenga E， et al. Clinical significance of CD56 expression in patients with acute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid and anthracycline-based regimens［J］. Blood， 2011， 117（6）： 1799-1805.

9 Breccia M， De Propris MS， Minotti C， et al. Aberrant phenotypic expression of CD15 and CD56 identifies poor prognostic acute promyelocytic leukemia patients［J］. Leuk Res， 2014， 38（2）：194-197.

10 Percherancier Y， Germain-Desprez D， Galisson F， et al. Role of SUMO in RNF4-mediated promyelocytic leukemia protein （PML）degradation： sumoylation of PML and phospho-switch control of its SUMO binding domain dissected in living cells［J］. J Biol Chem，2009， 284（24）：16595-16608.

11 Ahmad EI， Akl HKh， Hashem ME， et al. The biological characteristics of adult CD34+ acute promyelocytic leukemia［J］. Med Oncol， 2012， 29（2）： 1119-1126.

12 Miyamoto T， Iwasaki H， Reizis B， et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment［J］. Dev Cell， 2002， 3（1）： 137-147.

13 曾靜霞.急性早幼粒細胞白血病不同治療方案的療效分析［D］.太原：山西醫科大學，2011：1-35.

14 王克強， 亓云法， 王靜， 等. 急性早幼粒細胞白血病細胞形態學分型臨床意義分析［J］. 中華腫瘤防治雜志， 2014， 21（7）：538-542.

15 Grimwade D， Enver T. Acute promyelocytic leukemia： where does it stem from?［J］. Leukemia， 2004， 18（3）： 375-384.

16 Zhang L， Cao Z， Zou Y， et al. Quantification of PML/RARa transcript after induction predicts outcome in children with acute promyelocytic leukemia［J］. Int J Hematol， 2012， 95（5）： 500-508.

17 Albano F， Mestice A， Pannunzio A， et al. The biological characteristics of CD34+ CD2+ adult acute promyelocytic leukemia and the CD34 CD2 hypergranular （M3） and microgranular （M3v）phenotypes［J］. Haematologica， 2006， 91（3）： 311-316.

18 Varma N， Agarwal C， Varma S. Evaluation of PML immunofluorescence， flow cytometric immunophenotypic analysis，and reverse transcriptase polymerase chain reaction for PML/RARa for rapid diagnosis of acute promyelocytic leukemia［J］. Cancer，2011， 117（2）：435.