苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響及其機制

毛玲，汪順才，陳超，梁靚，左念，祝寅，李偉萍(句容市人民醫院，江蘇句容212400)

苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響及其機制

毛玲，汪順才，陳超，梁靚，左念，祝寅，李偉萍
(句容市人民醫院，江蘇句容212400)

摘要:目的探討不同濃度苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響及其機制。方法將對數生長期的人胃癌SGC-7901細胞隨機均分為觀察組和對照組。觀察組分別加入1.0、2.0、3.0 mg/mL苦參堿(分別為低、中、高濃度)，對照組不予處理。采用MTT法檢測兩組細胞增殖抑制率，流式細胞術檢測細胞凋亡率，RT-PCR法檢測程序性細胞死亡因子4( PDCD4) mRNA相對表達量。結果細胞增殖抑制率:對照組為8.19%±2.35%，觀察組低、中、高濃度分別為18.02%±3.13%、30.20%±3.52%、53.32%±2.72%;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。細胞凋亡率:對照組為4.06%±1.59%，觀察組低、中、高濃度分別為10.75%±2.36%、19.08%±4.39%、25.63%±1.96%;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。細胞PDCD4 mRNA相對表達量:對照組為0.35±0.06，觀察組低、中、高濃度分別為0.52±0.06、0.67±0.04、0.82±0.07;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。結論不同濃度苦參堿均可抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖、誘導其凋亡，并呈劑量依賴性;其作用機制可能與提高細胞內PDCD4 mRNA表達有關。

關鍵詞:胃癌;細胞增殖;細胞凋亡;苦參堿;程序性細胞死亡因子4

研究表明，腫瘤發生與腫瘤細胞增殖和凋亡異常有關;程序性細胞死亡因子4( PDCD4)基因是阻止細胞腫瘤性轉化的抑癌基因，在不同腫瘤細胞凋亡過程中，PDCD4基因存在不同程度的表達［1，2］。苦參堿是從中藥苦參中提取的一種新型藥物，主要通過調節腫瘤細胞基因表達而發揮抗腫瘤作用［3～5］。2012年8月～2014年11月，我們觀察了不同濃度苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，并探討其是否與PDCD4基因表達有關。

1　材料與方法

1.1材料人胃癌SGC-7901細胞購自中國科學院細胞庫。苦參堿(粉末，純度≥98%)購自中鑫科技生物有限公司，RPMI-1640培養基和FBS均購自賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司，四甲基偶氮唑藍( MTT)和二甲基亞砜( DMSO)均購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司。PDCD4 mRNA引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計及合成，β-actin由艾博思生物工程技術服務有限公司設計及合成。

1.2細胞培養人胃癌SGC-7901細胞在RPMI 1640培養基(含10% FBS及1%青霉素-鏈霉素)中，于37℃、5% CO2、100%濕度條件下傳代培養5～6 d傳代1次。

1.3苦參堿對細胞增殖抑制率影響的觀察采用MTT法。取對數生長期的SGC-7901細胞，調整細胞密度為1×104/mL，接種于96孔板中，隨機分為觀察組、對照組。觀察組分別加入1.0、2.0、3.0 mg/mL的苦參堿(分別為低、中、高濃度，每濃度設6個復孔)，對照組( 6個復孔)不予處理，作用24 h同時設置加入培養液的細胞作為空白對照。各組每孔加入MTT( 5 mg/mL) 20 μL，培養箱孵育4 h，吸去孔內培養上清液。加入DMSO 150 μL，震蕩15 min 于1 h內上酶標儀檢測其波長492 nm的吸光度，即OD492值。觀察組細胞增殖抑制率= (空白對照OD492－觀察組OD492)/空白對照OD492×100%，以同樣的方法計算對照組細胞增殖抑制率。

1.4苦參堿對細胞凋亡率影響的觀察采用流式細胞術。取對數生長期的SGC-7901細胞，以1 ×105/孔接種于6孔板中，隨機分為觀察組、對照

組。觀察組分別加入低、中、高濃度的苦參堿(每濃度設3個復孔)，對照組( 3個復孔)不予處理，作用24 h。4℃預冷的PBS洗滌2次，1 000 r/min離心10 min，重懸于200 μL的Binding Buffer中。加入10 μL的Annexin V-FITC后，室溫避光15 min，再加300 μL的Binding Buffer及5 μL的PI，充分混勻，于1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5苦參堿對細胞PDCD4 mRNA相對表達量影響的觀察采用RT-PCR法。取對數生長期的SGC-7901細胞，調整細胞密度為1×104/mL，接種于50 mL細胞培養瓶中。觀察組分別加入低、中、高濃度的苦參堿，對照組不予處理，對照組及觀察組各濃度均設3個樣本，作用24 h。采用TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度及完整性，以OD260/OD280在1.8～2.0為純凈RNA標準。按說明書步驟逆轉錄mRNA為cDNA。PDCD4上游引物: 5'-AAAGGCGACTAAGGAAAAACTCATC-3'，下游引物: 5'-GCCTATCCAGCAACCTTCCCT-3'，引物長度129 bp。β-actin上游引物: 5'-CGAAACTACCTTCAACTCCATC-3'，下游引物: 5'-AGTGATCTCCTTCTGCATCCT-3'，引物長度130 bp。擴增條件: 94℃預變性3 min，94℃變性30 s，58℃( PDCD4)或56℃(β-actin)退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環;最后72℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，利用電腦成像分析系統檢測PCR產物與β-actin的積分光密度比值，半定量分析目的基因相對表達量。

1.6統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組細胞增殖抑制率和凋亡率比較細胞增殖抑制率:對照組為8.19%±2.35%，觀察組低、中、高濃度分別為18.02%±3.13%、30.20%± 3.52%、53.32%±2.72%;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。細胞凋亡率:對照組為4.06%±1.59%，觀察組低、中、高濃度分別為10.75%±2.36%、19.08%±4.39%、25.63%±1.96%;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。

2.2兩組細胞PDCD4 mRNA表達比較對照組細胞PDCD4 mRNA相對表達量為0.35±0.06，觀察組低、中、高濃度分別為0.52±0.06、0.67±0.04、0.82±0.07;觀察組各濃度與對照組比較及觀察組各濃度間比較，P均＜0.05。

3　討論

苦參堿是中藥苦參的主要活性成分，具有抗炎抗過敏、抗纖維化、免疫調節及抗腫瘤等多種藥理活性。研究表明，苦參堿對多種腫瘤細胞(如人神經母細胞瘤細胞、白血病細胞、肺腺癌細胞等)均有明顯的殺傷作用［6～11］。其抗腫瘤作用機制主要有抑制腫瘤細胞增殖，誘導其分化凋亡，抗腫瘤細胞黏附與浸潤轉移，逆轉腫瘤細胞多重耐藥，抑制腫瘤新生血管形成以及增強化療藥物敏感性等。

目前，胃癌的發病機制尚不完全清楚。PDCD4是新近發現的一種具有磷酸酶活性的抑癌基因，具有阻止細胞腫瘤性轉化、抑制腫瘤細胞增殖及侵襲促進凋亡、參與細胞周期調控、提高抗腫瘤藥物化療敏感性等作用［5］。PDCD4基因定位于10q24，cDNA 長3.5 kb，其中編碼區約1.4 kb。PDCD4存在于大多數正常組織細胞的細胞核中，當細胞周圍環境發生改變時，可通過核輸出信號轉移到細胞質中。因此，PDCD4在某些細胞凋亡的誘導過程中表達上升，在某些侵襲性腫瘤中則表達下降［5］。研究發現，在多種惡性腫瘤(如胃癌、肝癌、腎母細胞瘤等)細胞中均可檢測到PDCD4 mRNA及蛋白表達減少甚至缺失，并與腫瘤惡性程度及患者預后密切相關［12］;胃癌組織PDCD4蛋白表達下降甚至缺失，并與胃癌低分化有關［13］。

本研究結果顯示，觀察組細胞增殖抑制率、細胞凋亡率、PDCD4 mRNA表達均隨苦參堿濃度升高而升高，且觀察組各濃度上述指標均明顯高于對照組。進一步證實苦參堿可抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖、誘導其凋亡，并呈劑量依賴性;其作用機制可能與提高細胞內PDCD4 mRNA表達有關。本研究結果為苦參堿治療胃癌提供了新的理論依據。

參考文獻:

［1］Bittoni A，Maccaroni E，Scartozzi M，et al.Chemotherapy for lo cally advanced and metastatic gastric cancer: state of the art and future perspectives［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2010，14 ( 4) : 309-314.

［2］Dong W，Chen X，Xie J，et al.Epigenetic inactivation and tumo suppressor activity of HAI-2 SPINT2 in gastric cancer［J］.Int Cancer，2010，127( 7) : 1526-1534.

［3］毛玲，薛天陽，許偉.苦參堿對人腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞趨化因子受體4表達的影響［J］.臨床兒科雜志，2014，32( 5) : 467-470.

［4］孟凡，張自翔，謝軍，等.苦參堿對人肝癌細胞HepG2凋亡和PEG10表達的影響［J］.實用醫學雜志，2014，30( 10) :1523-1526.

［5］Vikhreva PN，Shepelev MV，Korobko EV，et al.Pdcd4 tumo suppressor properties functions and possible applications in Oncolo gy［J］.Mol Gen Microbiol Virusol，2010，25( 2) : 3-11.

［6］羅娟，許偉，薛天陽，等.苦參堿對人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的作用機制［J］.實用兒科臨床雜志，2012，27 ( 3) : 190-191，214.

［7］李屹，張麗楠，楊磊.苦參堿藥理作用研究進展［J］.實用中醫藥雜志，2012，28( 5) : 423-424.

［8］毛玲，薛天陽，許偉.苦參堿聯合順鉑對人腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞PDCD4表達的影響［J］.中國當代兒科雜志，2014，16 ( 2) : 115-119.

［9］宋慶林，江梅.苦參堿對白血病HL-60細胞增殖、凋亡及其Bcl-2 mRNA、Survivin mRNA表達的影響［J］.山東醫藥，2014，54 ( 15) : 30-32.

［10］周娟，倪松石，賁素琴.苦參堿對人肺腺癌A549細胞增殖及HIF-1α、VEGF表達的影響［J］.山東醫藥，2012，52( 3) : 25-27.

［11］單廣夷，盛玉文.苦參堿對人膀胱癌EJ細胞株凋亡的影響及機制［J］.山東醫藥，2010，50( 11) : 43-45.

［12］Wang W，Zhao J，Wang H，et al.Programmed cell death 4 ( PD CD4) mediates the sensitivity of gastric cancer cells to TRAIL-in duced apoptosis by downregulation of FLIPexpression［J］.Exp Cel Res，2010，316( 15) : 2456-2464.

［13］馬鋼，劉江，張浩，等.程序性細胞死亡因子4在胃癌組織中的表達及臨床病理學意義［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13( 7) :481-484.

收稿日期:( 2015-01-29)

通信作者:汪順才，E-mail: wangshun1978@ sina.com

基金項目:江蘇大學醫學臨床科技發展基金資助項目( JLY20140074)。

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0023-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R329.26

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.008