基因芯片檢測技術與基因測序技術在遺傳性耳聾產前診斷中的聯合應用

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基因芯片檢測技術與基因測序技術在遺傳性耳聾產前診斷中的聯合應用

方媛，王傳霞，索峰，劉向紅

耳聾是最常見的出生缺陷之一[1]。60%的先天性耳聾伴有一定程度的遺傳性因素[2]。利用常規聽力物理篩查手段并不能夠解決日益增多的遲發性、漸進性和藥物敏感性耳聾的診斷及干預治療[3]。基因檢測技術能夠準確定位致病基因突變位點，了解疾病形成機理，有針對性也干預治療和預防疾病發生。對于中國人群耳聾致病基因特異性研究[4]表明，GJB2、GJB3、SLC26A4(PDS)、12s rRNA是主要的耳聾致病基因。本研究在遺傳性耳聾產前診斷中聯合應用基因芯片檢測技術與基因測序技術，現將結果報告如下。

臨床資料：選擇2013年10月～2015年10月就診于徐州市婦幼保健院的2 156例孕婦，年齡18～40歲。本研究經孕婦本人和家屬知情同意。

基因芯片檢測技術、基因測序技術應用方法：采集所有孕婦血液進行遺傳性耳聾微陣列芯片的篩查。采用博奧生物公司的晶芯@九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒，該試劑盒包括微陣列芯片及相關檢測和提取試劑。微陣列基因芯片包含4個中國人群常見的遺傳性耳聾致聾基因的9個突變熱點，分別是GJB2基因35delG、176、235delC、299的4個位點，GJB3基因538C>T的1個位點，SLC26A4(PDS)基因2168A>G、IVS-7-2A>G的2個位點，12s rRNA基因1494C>T、1555A>G的2個位點。芯片規格(76.20±0.50)mm×(25.40±0.25)mm×(1.00±0.10)mm，掃描區域22 mm×72 mm，檢測靈敏度≤0.1個熒光分子/μm2。對于GJB2和SLC26A4(PDS)基因突變的陽性病例，進一步針對其丈夫進行遺傳性耳聾基因測序檢測驗證。測序驗證首先通過合成9個突變熱點位置的針對性引物進行PCR擴增，通過Sanger測序法，利用一代測序儀3130X1基因分析儀進行測序及分析。針對孕婦及其丈夫都是同一基因型的病例，通過羊水穿刺術對胎兒進行確診診斷。

結果：2 156例孕婦中遺傳性耳聾陽性病例96例(4.45%)。其中陽性發現例數最多的是GJB2基因，其陽性突變例數58例(突變位點位于35delG、176、235delC、299分別為1、3、46、8例)。SLC26A4(PDS)基因陽性突變例數28例(突變位點位于2168A>G、IVS-7-2A>G分別為6、22例)。GJB3基因538C>T位點陽性突變5例。12s rRNA基因陽性突變5例，突變位點均位于1555A>G。共發現7對夫妻攜帶同一基因的陽性突變，其中GJB2基因共發現5對(突變位點均位于235delC，)，SLC26A4(PDS)基因共發現2對突變位點均位于IVS-7-2A>G。最終羊水穿刺確診2例GJB2基因純合突變胎兒，3例GJB2基因雜合突變，2例SLC26A4(PDS)基因雜合突變。

討論：遺傳性耳聾是一種相對比較復雜的遺傳性疾病，到目前為止，鑒定報道的與遺傳性耳聾有關的基因已有80多個，有67個常染色顯性/隱性遺傳基因，3個X連鎖耳聾基因和7個線粒體耳聾基因[5]，而致聾基因的致聾熱點突變非常密集。本研究根據最新的流行病學分析及臨床經驗總結，選取了4個最為常見的先天性致聾基因共計9個突變熱點進行大規模篩查，其陽性檢出率達4.45%，能夠較好地反映人群致聾基因的攜帶和分布情況[6]。選取的4個基因是基于常年大規模的中國人群遺傳性耳聾研究的結果基礎，具有廣譜性，適合進行篩查。對攜帶藥物敏感性耳聾基因(12s rRNA)的孕婦及胎兒進行用藥指導，終身禁用氨基糖苷類藥物，可在三級預防階段避免耳聾發生。本研究表明，GJB2和SLC26A4(PDS)基因突變率較高，分別為60.42%和29.17%，需要篩查機構引起重視。可見，芯片檢測結合基因測序技術對于指導遺傳性耳聾的產前篩查和診斷具有非常重要的作用。本研究過程中，由于微陣列基因芯片的篩查特性和經濟學效益限制，檢測的基因種類和突變位點相對偏少，需在以后的篩查過程中，逐漸下降經濟成本,逐步增加高危、高頻的基因種類并加入更多的突變位點，這對精確篩查有非常重要的指導作用。

參考文獻：

[1] Cohen M, Phillips JA 3rd. Genetic approach to evaluation of hearing loss[J]. Otolaryngol Clin North Am, 2012,45(1):25-39.

[2] Hilgert N, Smith RJ, Van Camp G. Forty-six genes causing nonsyndromic hearing impairment: which ones should be analyzed in DNA diagnostics[J]. Mutat Res, 2009,681(2-3):189-196.

[3] Zhang J, Wang P, Han B, et al. Newborn hearing concurrent genetic screening for hearing impairment-a clinical practice in 58,397 neonates in Tianjin, China[J]. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 2013,77(12):1929-1935.

[4] 張東紅,邱海濤,馬秀嵐,等.新生兒聾病基因GJB2, SLC26A4, 線粒體12S rRNA的分子流行病學研究[J].中國醫科大學學報,2010,39(8):649-651.

[5] H?kli S, Luotonen M, Sorri M, et al. Audiological follow-up of children with the m.1555A>G mutation in mitochondrial DNA[J]. Audiol Neurootol, 2013,18(1):23-30.

[6] 劉學忠,歐陽小梅,袁慧軍,等.中國人群遺傳性耳聾研究進展[J].中華耳科學雜志,2006,4(2):81-89.

收稿日期：(2015-09-06)

通信作者：顧茂勝

基金項目：徐州市醫學青年后備人才資金資助(2014011)。

doi：(徐州市婦幼保健院，江蘇徐州 221009)10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.042