海馬齒狀回區D1受體激活對血管性癡呆大鼠學習記憶能力的改善作用

萬朋，高俊濤，王丹，王師，金清華

(1 吉林醫藥學院生理學教研室，吉林吉林 132013；2 延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室)

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海馬齒狀回區D1受體激活對血管性癡呆大鼠學習記憶能力的改善作用

萬朋1，高俊濤1，王丹2，王師2，金清華2

(1 吉林醫藥學院生理學教研室，吉林吉林 132013；2 延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室)

摘要：目的觀察海馬齒狀回(DG)區D1受體激活對血管性癡呆(VD)大鼠學習記憶能力的改善作用。方法32只雄性SD大鼠，隨機分為假手術組、VD模型組1、VD模型組2、VD模型SKF38393激動劑組，各8只，后三組制備VD模型，后兩組采用腦部微量注射法于大鼠海馬DG區分別注射生理鹽水、D1受體激動劑SKF38393。應用Morris水迷宮進行大鼠學習記憶能力的行為學評估，HE染色法觀察大鼠海馬DG區病理組織形態學變化。結果 VD模型組1、假手術組逃避潛伏期分別為(75.73±4.41)、(50.13±4.48)s，兩組比較，P<0.05。VD模型組1、假手術組穿越原站臺區的次數分別為(2.67±0.67)、(7.67±0.88)次，兩組比較，P<0.05。HE染色結果顯示，VD模型組大鼠海馬DG區神經元數量明顯減少，可見壞死的神經元。VD模型組2和VD模型SKF38393激動劑組逃避潛伏期分別為(78.23±7.38)、(57.46±4.81)s，兩組比較，P<0.05。VD模型組2和VD模型SKF38393激動劑組穿越原平臺區的次數分別為(2.67±0.50)、(5.33±0.51)次，兩組比較，P<0.05。結論 海馬DG區的D1受體激活可改善VD大鼠受損的學習記憶能力。

關鍵詞：血管性癡呆；海馬DG區；D1受體；Morris水迷宮；學習記憶能力

血管性癡呆(VD)是一系列腦血管因素導致腦組織損害而引起的，以記憶、認知功能障礙為主要臨床表現的智能損害綜合征[1]。VD已成為全球第二大類型的癡呆[2]，預防和治療VD已成為社會廣泛關注的問題[3]。認知功能障礙是VD最顯著的臨床表現，海馬是認知功能的關鍵腦區[4]，VD的認知功能障礙程度與海馬萎縮相關[5]。海馬齒狀回(DG)區可能參與VD的空間學習和記憶障礙[6～9]。本課題組前期研究[10]證明，VD模型大鼠海馬DG區的DA含量減少，但對DG內D1受體在空間學習記憶中的作用尚未見報道。為此，本實驗觀察了海馬DG區D1受體激活對VD大鼠學習記憶能力的改善作用。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組成年雄性SD大鼠32只，體質量250～300 g，由延邊大學實驗動物科提供[許可證號：SCXK(吉)2011-0007]。將所有大鼠隨機分為假手術組、VD模型組1、VD模型組2和VD模型SKF38393激動劑組，各8只。

1.2VD模型大鼠的制備VD模型組1、VD模型組2、VD模型SKF38393激動劑組大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)進行麻醉，頸部正中線左側旁開0.5 cm處做一個長約1 cm的切口，分離頸總動脈后用醫用4號手術絲線雙重結扎。7 d后于頸部正中線右側旁開0.5 cm處做一個長約1 cm的切口，分離頸總動脈用醫用4號手術絲線雙重結扎。假手術組除了不結扎雙側頸總動脈，其余步驟均與上述相同。各組動物術后單獨飼養1周后合籠，并在模型制備完成30 d后進行模型的病理學和生理學的驗證，確定模型建立成功后開始進行下一步實驗[11]。

1.3SKF38393注射方法大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)行腹腔麻醉，手術根據Paxinos和Watson圖譜進行腦部定位，以前囟為參考點，將透析用外套管垂直插入固定于一側海馬DG區(定位坐標為AP 3.2 mm，L/R 1.6 mm，H 2.5 mm)。然后用牙科水泥將套管固定在大鼠顱骨上。適應環境24 h后將微量注射探針植入外套管內進行實驗。VD模型組2、VD模型SKF38393激動劑組分別在每天上午8時在大鼠海馬DG區內注射1 μL的生理鹽水和D1受體激動劑SKF38393，注射SKF38393的濃度為1 μg/μL，注射時間為1 min，30 min后進行Morris水迷宮訓練。

1.4大鼠學習記憶能力檢測利用Morris水迷宮觀察所有大鼠的學習記憶能力，包括定位航行試驗和空間探索試驗。Morris水迷宮檢測時，水池中水深約45 cm，水溫保持在(22±2)℃，將直徑10 cm的圓形平臺放于任一象限的中心位置，并淹沒于水面下約2 cm。定位航行試驗時，若大鼠在120 s內找到站臺，記錄所需的時間作為逃避潛伏期；若大鼠在120 s內未找到站臺，則將其引至站臺并停留15 s，潛伏期記為120 s。大鼠每天訓練1次，連續訓練4 d。水迷宮檢測第5天，進行空間探索試驗，即撤去水池中的圓形平臺，從同一個入水點將實驗動物放入水中，測量大鼠在120 s內穿越原站臺象限的次數。

1.5大鼠海馬DG區病理組織形態學觀察實驗結束后，取假手術組、VD模型組1大鼠的腦組織，在4%多聚甲醛中浸泡固定。將海馬組織用石蠟包埋，用切片機連續冠狀切片，片厚4 μm，隔三取一，用常規HE染色法觀察海馬DG區病理組織形態，分別在200倍和400倍光學顯微鏡下觀察海馬DG區神經元形態結構。

2結果

VD模型組1、假手術組逃避潛伏期分別為(75.73±4.41)、(50.13±4.48)s，兩組比較，P<0.05。VD模型組1、假手術組穿越原站臺區的次數分別為(2.67±0.67)、(7.67±0.88)次，兩組比較，P<0.05。HE染色結果顯示，假手術組海馬DG區神經元數量多，體積大，染色均一，結構完整，細胞膜、核膜清晰，核圓、核仁明顯；VD模型組大鼠海馬DG區神經元數量明顯減少，細胞排列紊亂，細胞外空隙增大，多數神經元細胞核呈固縮狀,胞質深染，細胞膜、核膜界限不清晰，可見壞死的神經元。

VD模型組2和VD模型SKF38393激動劑組逃避潛伏期分別為(78.23±7.38)、(57.46±4.81)s，兩組比較，P<0.05。VD模型組2和VD模型SKF38393激動劑組穿越原平臺區的次數分別為(2.67±0.50)、(5.33±0.51)次，兩組比較，P<0.05。

3討論

VD是由缺血、血管損傷出血、急慢性缺氧等一系列因素導致腦組織結構與功能廣泛受損而引起的，以認知功能障礙為特征的獲得性智能損害綜合征，它具有發病率高、病死率高、致殘率高等特點[12]。目前，基礎研究主要是通過觀察VD模型動物的相關行為，腦血流的變化，腦區細胞的形態、功能、生化等指標研究VD的發病機制[13]。利用雙側頸總動脈結扎法制備VD模型大鼠已廣泛用于癡呆的相關研究[11]，改良雙側頸總動脈永久性結扎法在保持傳統雙側頸總動脈結扎法優點的基礎上，大大提高了模型動物的存活率和模型制備成功率。本實驗利用改良雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型，并利用Morris水迷宮觀察其空間學習記憶能力。本研究結果顯示，在Morris水迷宮定位航行實驗中，VD大鼠的平均逃避潛伏期明顯長于假手術組；在Morris水迷宮空間探索實驗中，VD大鼠穿越原平臺區的次數明顯少于假手術組，提示本實驗制備的VD模型大鼠出現了空間學習記憶的損害。

海馬是學習記憶功能的重要腦區，它直接參與信息的儲存和再現過程，尤其在辨別空間信息、新異刺激和短時記憶向長時記憶的過度中起重要作用[14]。利用雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型時，隨著時間的推移，早期的急性腦缺血因基底動脈環的血流調節和側支循環的代償而有所改善，腦血流量趨于穩定，但海馬區得不到正常水平供血，造成慢性缺血，導致海馬區神經細胞損傷，最終引起VD的認知障礙[15]。本實驗VD大鼠海馬DG區HE染色可見神經元數量明顯減少，提示DG區神經元損傷可能是VD大鼠空間學習記憶損害的直接原因之一。同時本實驗結果發現，在VD大鼠海馬DG區微量注射D1受體激動劑SKF38393可明顯提高大鼠的學習記憶能力。有研究[16]證明，激活海馬內的D1受體能增加AMPA受體的表達，同時能修復損毀的海馬神經元。通過前期的研究，我們認為激活D1受體可加強興奮性氨基酸的興奮傳遞過程，并減弱GABA的抑制作用，進而易化空間學習記憶過程，但其具體的下游機制有待于進一步研究。

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·基礎研究·

收稿日期：(2015-08-10)

通信作者：金清華

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31160211)。

中圖分類號：R743；Q427

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)47-0023-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.008