顳葉癲癇大鼠癲癇持續狀態后海馬中let-7e和miR-23的表達變化

田小冰，程焱，宋毅軍

(天津醫科大學總醫院，天津 300052)

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顳葉癲癇大鼠癲癇持續狀態后海馬中let-7e和miR-23的表達變化

田小冰，程焱，宋毅軍

(天津醫科大學總醫院，天津 300052)

摘要：目的觀察顳葉癲癇大鼠海馬中let-7e和miR-23在癲癇持續狀態(SE)后不同時間點的表達變化。方法160只大鼠，隨機分為生理鹽水對照組10只、癲癇模型組150只，癲癇模型組制備氯化鋰-匹羅卡品誘導的顳葉癲癇大鼠模型，并將SE后不同時間點(0 h、1 h、6 h、12 h、1天、2天、7天、10天、30天、50天)分為10個組，每組15只。采用熒光實時定量PCR檢測各組大鼠海馬let-7e和miR-23。結果癲癇模型組SE后0 h、1 h、6 h、12 h、1天、2天、7天、10天、30天、50天let-7e相對表達量分別為0.61、0.84、0.85、1.40、10.74、0.71、0.65、1.52、1.69、0.13，miR-23相對表達量分別為0.27、0.31、0.41、0.39、4.49、0.21、0.18、0.12、0.83、2.40，與生理鹽水對照組比較，P均<0.05。結論 顳葉癲癇大鼠SE后海馬中let-7e和miR-23均先出現表達水平上調，24 h達到峰值后表達水平下調，let-7e在10～30天表達水平再次升高，miR-23在30～50天表達水平再次升高。

關鍵詞：顳葉癲癇；癲癇持續狀態；let-7e基因；miR-23基因；動物實驗模型；海馬

顳葉癲癇(TLE)是臨床常見的癲癇類型，但其發病機制目前尚不完全清楚[1,2]。microRNA(miRNA)是一種長度為22個核苷酸左右的非編碼蛋白的內源性RNA，在細胞中與靶基因特定序列相互作用，實現其生物學作用[3]。近年來，miRNA在神經系統疾病中的作用一直是神經病學的研究熱點[4]。研究[5]證實，let-7e廣泛表達于海馬中，并在神經系統的發生、分化過程中起重要調節作用。miR-23在神經分化過程中僅存在于星形膠質細胞[6]，并參與調控細胞生長和細胞凋亡[7]，對腦神經髓鞘的形成及形態維持也有重要的調節作用[8]。我們的前期研究[9]結果發現，與正常大鼠相比，顳葉癲癇大鼠海馬組織中差異表達的miRNA有23個，let-7e差異性表達下調，miR-23a/b差異性表達上調。本研究進一步觀察了顳葉癲癇大鼠海馬中let-7e和miR-23在癲癇持續狀態(SE)后不同時間點的動態表達變化規律，為探明它們在顳葉癲癇中的作用打下基礎。

1材料與方法

1.1動物和試劑實驗用二級SD大鼠160只，雄性，鼠齡3～4個月，體質量(300±20)g，由北京維通利華動物中心提供。實驗前適應性飼養1周，觀察無自發性癲癇發作入選。所有大鼠隨意飲水、進食，保持12 h白晝及12 h黑夜的周期環境。動物飼料由Beijing HTK公司提供。匹羅卡品購自永光制藥有限公司(批號：H20013263)，地西泮和硫酸阿托品購自天津金耀氨基酸有限公司。TRIzol Reagent和DEPC treated water購自美國Invitrogen公司。無水乙醇、氯仿、異丙醇購自天津生化廠。RNA-free Eppendorf管及TIPs購自北京索來寶科技公司。Let-7e、miR-23和U6 Hairpin-itTMmiRNAs Quantitaion Kit購自上海GenePharma公司。Agarose購自Biowest公司。

1.2顳葉癲癇大鼠模型的制備及分組將160只大鼠隨機分為生理鹽水對照組10只、癲癇模型組150只。顳葉癲癇模型的制備方法和認定方法詳見文獻[2]。其中癲癇模型組大鼠根據SE后不同時間點(0 h、1 h、6 h、12 h、1天、2天、7天、10天、30天、50天)分為10個組，每組15只。

1.3海馬組織let-7e、miR-23檢測方法將各組大鼠斷頭處死后根據Pellegrino大鼠腦立體定位圖譜，在60 s內將海馬組織從大腦中剝離出來，迅速置入凍存管投入液氮中保存。參照TRIzol Reagent說明書提取海馬組織總RNA，用Nanodrop分光光度計測量濃度，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物質量。按照Hairpin-itTMmiRNAs Quantitaion Kit說明書分別對let-7e、miR-23和U6進行逆轉錄反應。反應體系為20 μL，RNA上樣量為200 ng，反應條件為16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、10 min。將逆轉錄產物置于-20 ℃保存。按照Hairpin-itTMmiRNAs Quantitaion Kit說明書對miRNA逆轉錄產物進行PCR擴增，儀器為DNA Engine Opticon 2 PCR，反應條件為95 ℃、3 min預變性，95 ℃、12 s變性，62 ℃、40 s退火延伸，62 ℃讀板，共40個循環。反應結束用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物質量。其中，let-7e引物序列的F-Primer為CATTCTCTCAGATG-AGGTAGGAGG；R-Primer為TATGGTTGTTCTGCTC-TCTGTGTC。miR-23引物序列的F-Primer為TCACACTATATCACATTGCCAGG；R-Primer為TATGGTTGT TCTGCTCTCTGTCTC。Homo U6 snRNA引物序列的F-Primer為ATTGGAACGATACAGAGAAGATT；R-Primer為GGAACGCTTCACGAATTTG。

1.4統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。由Opticon Monitor 2軟件獲得PCR擴增產物原始CT值。實驗數據參照Schmittge等[10]發表于Nature protocols上的方法，以mean 2-ΔCT±S.D.(C.V.)表示各組結果，其中2-ΔCT=2-Δ(CT目的基因-CT內參基因)。各時間組基因相對表達量(RQ)=2-ΔCT處理組/2-ΔCT正常組。組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

海馬總RNA擴增條帶清晰，無雜帶及拖尾現象，各基因擴增條帶均一，片段長度均在50～100 bp。各組取7只大鼠，以Homo U6 snRNA標準化，生理鹽水對照組、癲癇模型組0 h、1 h、6 h、12 h、1天、2天、7天、10天、30天、50天let-7e相對表達量分別為0.016 80±0.002 60(15.3%)、0.010 19±0.001 10(10.7%)、0.014 07±0.000 80(5.3%)、0.014 30±0.001 10(7.9%)、0.023 56±0.004 80(20.5%)、0.180 38±0.026 90(14.9%)、0.011 99±0.001 20(9.7%)、0.010 91±0.002 00(18.4%)、0.025 57±0.004 20(16.5%)、0.028 42±0.003 20(11.4%)、0.002 22±0.000 30(13.4%)；癲癇模型組各時間點RQ分別為0.61、0.84、0.85、1.40、10.74、0.71、0.65、1.52、1.69、0.13，與生理鹽水對照組比較，P<0.05或<0.01。各組取7只大鼠，以Homo U6 snRNA標準化，生理鹽水對照組、癲癇模型組0 h、1 h、6 h、12 h、1天、2天、7天、10天、30天、50天miR-23相對表達量分別為0.052 64±0.008 00(15.2%)、0.014 19±0.002 80(19.5%)、0.016 35±0.000 90(5.6%)、0.021 39±0.001 80(8.5%)、0.020 64±0.004 20(20.3%)、0.023 63±0.030 80(13.0%)、0.010 87±0.002 10(19.8%)、0.009 49±0.001 70(18.3%)、0.006 21±0.000 80(14.1%)、0.043 63±0.001 50(3.3%)、0.126 40±0.022 20(17.5%)；癲癇模型組各時間點RQ分別為0.27、0.31、0.41、0.39、4.49、0.21、0.18、0.12、0.83、2.40，與生理鹽水對照組比較，P<0.05或<0.01。

3討論

近年來，研究miRNA在顳葉癲癇中的作用已成為癲癇研究領域的熱點之一。我們對慢性期顳葉癲癇大鼠海馬通過miRNA微陣列技術進行分析發現，有包括let-7e和miR-23a/b在內的多種miRNA表達異常。這一前期研究僅篩查了慢性期顳葉癲癇大鼠海馬中差異性表達的miRNA，并不了解這些差異性表達的miRNA在SE至慢性顳葉癲癇形成過程中的動態變化規律。

本研究結果顯示，匹羅卡品所致顳葉癲癇的急性期(SE后1周內)，let-7e和miR-23均先出現表達水平上調，24 h達到峰值后表達水平下調，在SE后24 h，let-7e和miR-23的表達水平分別達到了正常大鼠的10.7倍和4.49倍，至1周時，let-7e和miR-23的表達水平甚至低于正常大鼠(下調表達，RQ<1)。在慢性期(SE后2周至2月)，let-7e在SE后10天和30天表達水平明顯上調，在50 d時又下調表達至非常低的水平(RQ=0.13)；miR-23在SE后7～10 d表達水平明顯下調，在SE后30～50天時表達明顯上調，至SE后50天其表達水平為正常大鼠的2.4倍。這一研究結果在國內外首次表明了let-7e和miR-23在癲癇大鼠SE后海馬內不同時間點的表達變化規律，為進一步探討它們在顳葉癲癇發生過程中的作用打下了基礎。

目前研究認為突觸重塑和苔蘚纖維發芽在顳葉癲癇的形成過程中發揮重要作用。在匹羅卡品誘導的顳葉癲癇大鼠模型中，SE后24 h是突觸重塑發生的早期階段[11]，而此時期let-7e和miR-23表達量達到峰值。我們推測，這兩種miRNA可能參與調控突觸重塑的過程，與苔蘚纖維發芽密切相關。miR-23在神經分化過程中僅存在于星形膠質細胞，其在細胞缺氧環境中表達明顯下調[12]，并參與調控細胞生長與凋亡，我們推測其通過參與調控星形膠質細胞的增生，參與顳葉癲癇的發生過程。let-7e和miR-23在SE后大鼠海馬中的表達變化，尤其是SE后24 h表達明顯上調，推測它們可能通過某種作用機制參與顳葉癲癇的發生過程。

探明let-7e和miR-23調控的靶基因對進一步研究let-7e和miR-23在顳葉癲癇中的作用非常必要。let-7e通過調控Ras和HMGA2等基因的表達，在腫瘤形成過程中發揮重要作用[13,14]，通過調控miRNP相關蛋白FMRP在胚胎干細胞的神經分化中發揮調節作用[15]，并可通過調控TLR4在致炎機制中發揮作用[16]。miR-23b參與調控hes1 mRNA轉錄后表達參與神經分化過程，miR-23負調控PGC-1a基因影響骨骼肌活性[17]。本研究結果闡明了SE后顳葉癲癇海馬中不同時間點let-7e和miR-23的表達水平變化規律，let-7e和miR-23是否也通過調控這些基因參與到顳葉癲癇的致病過程，還有待進一步深入研究來證實。

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Expression changes of let-7e and miR-23 in hippocampus of rats with

temporal lobe epilepsy after status epilepticus

TIANXiao-bing,CHENGYan,SONGYi-jun

(GeneralHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300052,China)

Abstract:Objective To detect the expression changes of let-7e and miR-23 in the hippocampus of rats with temporal lobe epilepsy (TLE) at different time points after status epilepticus (SE). MethodsA total of 160 rats were randomly divided into the control group (n=10) which was injected with normal saline, and the TLE group (n=150) which was induced by lithium-pilocarpine. TLE group was divided into 10 subgroups by different time points (0 hour, 1 hour, 6 hours, 12 hours, 1 day, 2 days, 7 days, 14 days, 30 days and 50 days) after SE and each subgroup was consist of 15 rats. The real-time fluorescent quantitative PCR was performed to detect the expression changes of let-7e and miR-23 in all rats. ResultsThe relative expression levels of let-7e in the TLE subgroups were 0.61, 0.84, 0.85, 1.40, 10.74, 0.71, 0.65, 1.52, 1.69 and 0.13at the time points of 0 h, 1 h, 6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 7 d, 14 d, 30 d and 50 d. When we compared with that of the normal saline group, significant differences were found (all P<0.05). The relative expression levels of miR-23 in the TLE subgroups were 0.27, 0.31, 0.41, 0.39, 4.49, 0.21, 0.18, 0.12, 0.83 and 2.4 at the time points of 0 h, 1 h, 6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 7 d, 14 d, 30 d and 50 d. When we compared with that of the normal saline group, significant differences were found (all P<0.05).ConclusionsThe expression of let-7e and miR-23 in the hippocampus of TLE rats was first up-regulated to the peak value at 24 h after SE and then it began to down-regulate. A second up-regulated expression was seen from 10 d to 30 d after SE with let-7e and from 30 d to 50 d with miR-23.

Key words:temporal lobe epilepsy; status epilepticus; let-7e; mir-23 gene; experimental animal model; hippocampus

收稿日期：(2015-06-25)

通信作者簡介：宋毅軍(1972-)，男，主任醫師，教授，研究方向為腦血管病、癲癇的診斷與治療。E-mail: songyijun2000@gmail.com

作者簡介：第一田小冰(1985-)，男，主治醫師，研究方向為腦血管病、癲癇的診斷與治療。E-mail:xbtian@tmu.edu.cn

基金項目：天津市應用基礎及前沿技術研究計劃(10JCYBJC13800)。

中圖分類號：R742.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)47-0007-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.003