缺氧腸上皮細胞自噬的變化及意義

陳 剛，孫春紅，閆柏剛

自噬(autophagy)是由Ashford和Porter［1］在1962年發現細胞內存在“自己吃自己”的現象后提出，系指由細胞粗面內質網或高爾基體等脫落的雙層膜包裹部分細胞質和受損的細胞器及蛋白質，而后與溶酶體融合降解其所包裹內容物，從而實現細胞本身的代謝需要和細胞器的更新［2］。據研究［3-5］，自噬在細胞生長發育中起重要作用，且在各種應激及疾病如缺血缺氧性損害、腫瘤、神經退化等病理過程中也扮演著至關重要的角色。嚴重燒傷或創傷后易發生失血性休克，導致全身組織缺血缺氧，為保證心腦血管等重要臟器血流供應，機體常出現代償反應，即血液重分布，在血液重分布情況下腸道又是最常受累的器官，由腸道組織灌流不足、氧需求增加及高代謝所造成的缺氧，導致腸黏膜結構與功能受損。缺血缺氧所致胃腸道上皮細胞的自噬情況目前研究甚少，本研究利用體外缺氧模型模擬胃腸道缺血缺氧，動態觀察Caco-2腸上皮細胞在缺氧條件下的自噬變化情況，旨在了解缺氧對腸上皮細胞自噬的影響，為研究自噬在缺氧后腸上皮損害中的作用奠定基礎。

材料與方法

1 實驗材料

Caco-2腸上皮細胞株由中國科學院上海細胞研究所提供，P62抗體、Beclin1抗體、β-肌動蛋白(βactin)抗體購自美國SIGMA公司，微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗為美國Southern Biotech公司產品，綠色熒光蛋白(GFP)-LC3B由第三軍醫大學生物醫藥中試研究基地唐彬博士贈送，改良伊格爾培養基(DMEM)及還原血清培養基(OPTI-MEM)均購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自BBI公司，常氧培養箱和缺氧培養箱均購自美國Thermo Scientific公司，超敏化學發光檢測試劑盒為Advansta公司產品，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜為Millipore公司產品，蛋白印跡相關試劑﹑蛋白測定試劑盒﹑電轉儀﹑電泳儀及ChemiDoc XRS型凝膠圖像分析系統均購自美國Bio-Rad公司，UD-201型組織細胞超聲破碎儀購自日本TOMY公司，冷凍離心機AllegraTMX-22R購自美國Beckman公司，TCS SPS型激光共聚焦顯微鏡為德國Leica公司產品，H-600型透射電鏡為日本日立公司產品。

2 細胞培養與處理

Caco-2細胞用含體積分數為10%胎牛血清(FBS)、100μg/mL鏈 霉 素、100U/mL青 霉 素、2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L非必需氨基酸、pH7．4的DMEM培養基培養，當細胞長至約90%融合時，用25g/L胰蛋白酶及0．53mmol/L乙二胺四乙酸液消化，按1∶3比例傳代培養。將細胞接種于6孔板，隔天更換培養液，直到細胞完全融合。將細胞接種于含蓋玻片(鼠尾膠原包被)的24孔板，到細胞貼壁后處理。

細胞缺氧處理按照文獻方法［6］進行，將細胞完全融合的6孔板放入缺氧培養箱中，充入由體積分數為1%O2、5%CO2和94%N2組成的混合氣體(重慶朝陽氣體廠)，放置于37°C細胞培養箱中培養。根據缺氧時間不同將細胞分為常氧組(缺氧0h)，缺氧(0．5、1、2、6、12、24h)組。將鼠尾膠原包被蓋玻片的24孔板分為常氧組(正常培養箱中培養6h)和缺氧6h組。

3 檢測指標與方法

3.1 腸上皮細胞Beclin1、P62和LC3蛋白表達的檢測 采用蛋白質免疫印跡法［7］檢測，以β-actin作內參，方法簡述如下:用4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細胞后即加入細胞裂解液放置冰上低溫裂解細胞，收集樣本于1．5mL尖底離心并用細胞超聲破碎儀破碎，離心(12 000r/min、10min、4℃)，取上清液煮沸5min，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳并轉移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，然后分別加入兔抗Beclin1抗體、兔抗P62抗體、兔抗LC3抗體及鼠抗β-actin抗體，4℃孵育過夜。次日以吐溫-20-三羥甲基氨基甲烷鹽緩沖液(TBST)洗膜4次后分別加入二抗HRP-羊抗兔IgG和HRP-羊抗鼠IgG，室溫孵育1h。再次用TBST洗膜4次后加入化學發光液，用凝膠圖像分析系統采集發光信號。Quantity One軟件對蛋白表達行相對定量分析，Beclin1及P62蛋白表達量分別以Beclin1或P62與LC3Ⅰ蛋白的比值表示，LC3蛋白表達量以LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值表示。

3.2 透射電鏡檢測自噬 用細胞刮常規收集6孔板貼壁細胞，置于尖底離心管離心(1 000r/min、8min)，吸去上清液，加入2．5%戊二醛固定液固定細胞團，4℃固定2h后用PBS漂洗3次，15min/次。再于1%鋨酸固定液固定2h后用PBS漂洗3次，15min/次。乙醇梯度脫水后用環氧樹脂和丙酮等體積混合滲透過夜，聚合器中聚合，環氧樹脂618包埋，半薄切片定位、超薄切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，置于H-600型透射電鏡下觀察并拍照。

3.3 GFP-LC3B融合蛋白示蹤自噬體形成 擴增GFP-LC3B融合蛋白表達載體質粒，抽提質粒DNA并用紫外分光光度儀測定其濃度與純度后備用。將細胞接種于24孔板中的蓋玻片上，待其生長24h后，嚴格按照Lipofectamine 2000質粒轉染試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書的方法進行瞬時轉染。轉染24h后，將細胞分別置于常氧培養箱及缺氧培養箱培養，6h后用PBS漂洗5min，1%多聚甲醛(PFA)固定30min，PBS漂洗3次(5min/次)后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

4 統計學分析

數據采用SPSS17．0統計軟件行統計學分析，以ˉx±s(均數±標準差)表示，多組間均數比較運用單因素方差分析，P＜0．05有統計學意義，P＜0．01有顯著統計學意義。

結 果

1 缺氧后自噬相關蛋白Beclin1、P62和LC3蛋白表達的變化

如圖1、2、3免疫印跡結果及表1定量分析結果所示，與正常對照(0h)相比較，缺氧后腸上皮細胞Beclin1及LC3蛋白表達均呈逐漸增加趨勢，且均在缺氧后12h蛋白表達達到峰值，至缺氧后24h蛋白表達雖有所回落，但仍顯著高于正常對照。P62蛋白表達在缺氧后進行性降低，至缺氧后24h降至最低。

圖1 缺氧后腸上皮細胞Beclin1蛋白表達的變化

圖2 缺氧后腸上皮細胞P62蛋白表達的變化

圖3 缺氧后腸上皮細胞LC3蛋白表達的變化

表1 缺氧后腸上皮細胞Beclin1、P62和LC3蛋白表達定量分析結果(ˉx±s)

2 缺氧后自噬溶酶體的變化

自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，直接觀察自噬體需在透射電子顯微鏡下。因此，透射電鏡觀察是目前確認是否發生自噬的最重要形態學指標，被認為是檢測是否發生自噬的金標準。筆者也利用透射電鏡觀察了缺氧對腸上皮細胞自噬溶酶體變化的影響。由于上述自噬相關蛋白Beclin1、P62及LC3蛋白表達均在缺氧后6h與正常對照有顯著差異，因此我們觀察了缺氧后6h腸上皮細胞自噬溶酶體的變化情況。圖4的結果表明，與正常對照相比較，缺氧后腸上皮細胞內自噬溶酶體數目明顯增多(圖中箭頭所示)，表明缺氧后腸上皮細胞自噬增強。

圖4 缺氧后腸上皮細胞自噬溶酶體的變化

3 缺氧后GFP-LC3B融合蛋白示蹤的變化

GFP-LC3B融合蛋白示蹤技術的原理是利用LC3B在自噬形成過程中發生聚集這一現象，無自噬時GFP-LC3B融合蛋白彌散地分布于胞漿內;發生自噬時GFP-LC3B融合蛋白轉位至自噬體膜聚集，在熒光顯微鏡下可觀察到多個明亮的綠色熒光斑點。筆者采用GFP-LC3B融合蛋白示蹤方法觀察了缺氧后6h腸上皮細胞自噬的發生情況，圖5的結果表明，正常對照的腸上皮細胞內分布較均勻一致的綠色熒光，而熒光斑點形成較少;缺氧后6h的腸上皮細胞內綠色熒光斑點形成明顯增多，表明缺氧后腸上皮細胞自噬明顯增加。

圖5 缺氧后GFP-LC3B融合蛋白示蹤的變化

討 論

嚴重燒傷早期最主要的病理生理變化為大量體液滲出，有效循環血量銳減，使機體處于休克狀態，導致全身組織缺血缺氧，故嚴重燒傷早期全身性損害的實質是組織器官的缺血缺氧性損害。有資料表明［8］，腸系膜血管的血管緊張素受體密度比其他部位高，故對血管加壓素敏感性高，休克時腸系膜血流量顯著減少，而機體為了保證心腦等重要臟器的血流灌注，通過血流重分布方式“犧牲”腸道等相對不重要器官的血流以維持心腦等血流灌注，這就使得腸道等的血流灌注量更進一步降低，導致腸道黏膜缺血缺氧。既往的研究表明［9］，嚴重燒傷早期缺血缺氧時腸黏膜組織結構損害、腸道屏障功能受損及通透性增加，引起腸腔內細菌及內毒素移位。但是，迄今為止，嚴重燒傷早期腸黏膜損害的機制仍不完全清楚。

近年來，自噬在組織缺血缺氧性損害中的作用已受到廣泛關注。據國外文獻報道［10-11］，在缺氧時結腸癌HT-29細胞自噬相關蛋白LC3表達增加及P62表達降低，表明缺氧后細胞自噬作用增強。在小鼠模擬急進高原實驗研究發現［12］，急進高原組小鼠腸道機械屏障受損傷且腸道上皮細胞內自噬相關蛋白LC3及Beclin1表達升高，但自噬作用的上調與腸道機械屏障損傷的關系目前尚不明確。筆者最近的研究也發現［13］，在小鼠嚴重燒傷早期，重要臟器如心、肝、肺、腎組織的自噬標志分子Beclin1及LC3蛋白表達升高，自噬溶酶體增多，表明嚴重燒傷可引起組織細胞自噬增加。腸道作為應激反應的中心器官，缺血缺氧時腸黏膜上皮細胞自噬是否也增加呢?目前的研究資料尚不能明確回答這一問題。為此，本實驗利用體外缺氧模型，研究了缺氧條件下人腸上皮細胞自噬的動態變化。實驗結果表明，腸上皮細胞在缺氧0．5h后，自噬相關蛋白Beclin1和LC3的蛋白表達水平均開始增加，且隨著缺氧時間的延長而進一步增加，到缺氧12h達到峰值，至24h雖有回落，但仍顯著高于正常水平。與此相反，另一種自噬相關蛋白P62的蛋白表達則隨著缺氧時間的延長逐漸降低，到缺氧24h時降至最低。過去的研究表明［14］，自噬相關蛋白Beclin1、LC3及P62均在自噬的發生與發展中起著非常重要的作用，被認為是細胞自噬形成的標志性分子。Beclin1蛋白與自噬過程中形成吞噬小泡的起始密切相關;LC3定位在自噬體雙層膜的整個延長階段，且貫穿整個自噬過程;P62在自噬過程中作為一種調節因子參與自噬，但在自噬晚期被逐漸降解。很顯然，本實驗觀察到的缺氧后Beclin1與LC3蛋白表達增加及P62蛋白表達降低表明了缺氧狀態下腸上皮細胞自噬增強。本實驗的透射電鏡結果也表明，缺氧后腸上皮細胞內自噬溶酶體數目增加;進一步的GFP-LC3B融合蛋白示蹤結果更是表明，缺氧后腸上皮細胞內綠色熒光斑點形成明顯增多，即自噬溶酶體增加，這些均與上述缺氧后腸上皮細胞Beclin1、LC3及P62這三種自噬相關蛋白表達的變化趨勢相吻合。因此，綜合本實驗的結果，筆者認為缺氧能引起腸上皮細胞自噬明顯增強。

目前的研究認為，自噬在機體的各種生命活動中發揮著重要作用，適度的自噬可加速細胞新陳代謝及細胞器更新，參與缺血缺氧等饑餓狀態下細胞適應性反應的調節，但過度的自噬則引起自噬性細胞死亡，導致組織損害［4-14］。因此，自噬究竟是起保護性作用，還是損傷性作用，目前還存在較大的爭議。近期有研究發現，特異性抑制嚴重燒傷早期缺血缺氧時心肌細胞的自噬，能明顯減少心肌細胞過度死亡，減輕心功能損害，表明心肌細胞自噬增加參與了嚴重燒傷早期缺血缺氧時心肌組織功能損害的發生［15］。過去的研究表明，缺氧可引起培養的人腸上皮細胞緊密連接相關蛋白發生改變，導致緊密連接屏障功能損害［16］。本實驗發現的缺氧能引起腸上皮細胞自噬水平明顯增強，是否與缺氧后腸上皮細胞緊密連接相關蛋白改變及屏障功能損害有關，目前尚難以明確，筆者將對此進行深入研究。

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