壯通飲對糖尿病腎病大鼠腎小球病理改變的影響

江旭鋒　曾慶春　劉軍杰　劉燕平　黃炳臣　黃永秩　黃岑漢

【摘要】目的實驗性研究壯通飲（ZTY）對DN大鼠腎小球病理改變的影響。方法采用單腎切除合并腹腔空腹注射鏈脲佐菌素（STZ），建立DN大鼠模型，并隨機分為空白對照組、假手術組、模型組、西藥組和壯通飲低劑量組、中劑量組、高劑量組7個組。治療組每日灌胃，壯藥組用壯通飲（低劑量組6.8 g/kg，中劑量組13.6 g/kg，高劑量組27.2 g/kg），西藥組用卡托普利1 g/kg。于實驗給藥治療6周后，檢測各組大鼠血糖、體重、右腎指數，且通過光鏡、透射電鏡觀察各組大鼠腎小球的病理改變。結果與空白對照組比較，假手術組各項指標檢測均無明顯差異（P>005）；模型組及各治療組24 h尿蛋白量、血糖、右腎指數及體重均降低，差異有統計學意義（P<0.05）；HE、PAS染色及電鏡下，模型組與各治療組均出現不同程度的病理改變，其中模型組病理改變最明顯，腎小球明顯肥大、基底膜增寬、系膜區明顯增生，毛細血管腔明顯變窄，陽性物質明顯增多，系膜基質明顯增多，腎小球內毛細血管呈節段性硬化，毛細血管管腔狹窄，足細胞的足突融合、消失。與模型組比較，各治療組24 h尿蛋白量、血糖、右腎指數均降低，差異有統計學意義（P<005），而體重雖有所改善，但差異無統計學意義（P>005）；HE、PAS染色及電鏡下，各治療組病理改變均有不同程度的減輕，其中壯通飲中劑量組減輕最為明顯。而各治療組之間，雖然壯通飲中劑量組各項檢測指標及病理改變的減輕、改善程度最為明顯，但與其他治療組相比差異無統計學意義（P>005）。結論壯通飲可以改善DN大鼠的一般情況，減輕腎小球病理學改變，對DN大鼠的腎臟具有一定的保護作用。

【關鍵詞】壯通飲；糖尿病腎病；腎小球；病理改變；實驗研究

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.01.001

糖尿病腎病（DN）是糖尿病（DM）常見的嚴重微血管并發癥，隨著患者病情的發展，本病對腎臟具有不可逆的損害，終致腎功能衰竭及尿毒癥，致死致殘。伴同我國DM患病率的增長與人口老齡化的趨勢[1]，潛在的DN患者數量也因此增加。壯通飲（ZTY）為民間壯藥方，以壯醫“人體三道兩路”理論為基礎，由扶芳藤、參三七和黃花倒水蓮3味壯藥組成，常用于治療“啊肉甜水毒”（糖尿病腎病水腫）。臨床已有應用壯通飲治療高脂血癥、腦梗死[2，3]等，我們就壯通飲對DN大鼠腎小球病理改變的影響進行實驗研究，旨在為壯通飲臨床治療DN提供理論依據。1材料與方法1.1實驗動物及分組SPF級純種SD大鼠140只，雌雄各半，體重（200±20）g，鼠齡4個月，檢疫合格，血糖正常，由廣西醫科大學動物實驗中心提供（合格證編號：SCXK桂2009-000）。給予普通飼料、自由飲水，適應性飼養1周后，隨機取10只為空白對照組，20只為假手術組，其余為造模組。參照模型制備和成模標準[4]，將假手術組與造模組皆以10%水合氯醛3.0 ml/kg腹腔注射麻醉，但假手術組僅切開皮層、肌層，不切除腎臟并縫合，而造模組結扎左腎門血管行左腎切除術并縫合，且于術后恢復2周后，禁食12 h，以2%鏈脲佐菌素 （STZ）溶液50 mg/kg，一次性腹腔注射造模。72 h后測尾靜脈血糖，其值≥16.7 mmol/L即為造模成功。之后繼續飼養1個月，造模組微量白蛋白>30 mg/d后，隨機取30只為模型組，其余為治療組（西藥組和壯通飲低劑量組、中劑量組、高劑量組）各20只。各治療組大鼠每日灌胃量為：壯通飲各組用壯通飲水煎液（低劑量組6.8 g/kg，中劑量組13.6 g/kg，高劑量組27.2 g/kg），西藥組用卡托普利液（10 mg/kg）。模型對照組與假手術組大鼠：用0.5% CMCNa，按“100 g/ml”大鼠體重與灌胃體積比灌胃。空白組不予處理。各組大鼠自由飲水和標準飲食，每天9：00～10：00一次性灌胃，連續灌胃用藥6周。

1.2實驗藥品及設備

1.2.1壯通飲水煎液及卡托普利液制備壯通飲水煎液：按中藥飲片（廣西柳州百草堂藥業有限公司，批號：20131023）“扶芳藤∶黃花倒水蓮∶參三七=6∶4∶3”的用藥質量比稱取，將三藥一并加適量蒸餾水浸泡過夜（參三七打成粉末并紗袋包裝），加熱至沸騰，改用文火煎煮1 h，濾出藥液，加水再次煎煮1 h，后將兩次煎液合并，且濃縮至含生藥為2.72 g/ml的壯通飲高劑量組濃度，然后依次取其適量體積，倍比稀釋至含生藥為1.36 g/ml、0.68 g/ml的壯通飲中劑量組、低劑量組濃度。卡托普利液：將卡托普利片（規格：25 mg/片，廣東臺城制藥股份有限公司，批號：20130302）研磨成粉末，按1 mg/ml的濃度配制。上藥均分裝滅菌，4℃保存備用。

1.2.2其他實驗藥品與設備水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號：20130513）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司，批號：90513038）；目測尿蛋白試紙（廣州市花都高爾寶生物技術有限公司，批號：20130717），尿蛋白定量測試盒（由右江民族醫學院附屬醫院檢驗科提供）。日立7060全自動生化分析儀（由右江民族醫學院附屬醫院檢驗科提供，型號：7600020）；安穩血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；HMIAS2000W高清晰度彩色醫學圖文分析管理系統（由右江民族醫學院附屬醫院病理科提供，型號：LOGENEI）；透射電鏡（TEM，由廣西醫科大學提供，型號：日立H7650）。

1.3實驗方法

1.3.1一般情況的測定于末3次給藥后，連續收集3次各組大鼠的24小時尿液，用于檢測24 h尿蛋白量（24 h尿蛋白量=尿蛋白定量×24 h尿量）。于末次給藥后，給各組大鼠稱重并測尾靜脈血糖，禁食 （不禁水 ）10 h，行10%水合氯醛3.5 g/kg腹腔注射麻醉，取出右腎，剝離被膜稱右腎質量，計算右腎指數（即右腎質量與體重比，單位：mg/g）。endprint

1.3.2腎小球病理改變觀察取各組大鼠右腎，經腎門縱向剖開，用10%福爾馬林固定50%的腎組織、經常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片，分別行HE、PAS染色，應用病理圖像分析系統對各組大鼠腎小球的病理改變做光鏡分析。取各組大鼠腎皮質1 mm3，常規透射電鏡制作樣本，超薄切片，應用日立H7650型透射電鏡，放大倍數：10 000倍，常規觀察腎小球病理改變并攝片。

1.4統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組計量資料的比較采用ANOVA檢驗，進一步兩兩比較采用SNK檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1一般資料動物飼養過程中，假手術組死亡6只、模型組死亡16只、西藥組死亡7只；壯通飲低劑量組、中劑量組、高劑量三組各死亡10只。死亡原因可能是感染、血糖過高，尤其是模型組無藥物的治療。

2.2壯通飲對DN大鼠一般情況的影響與空白組相比，假手術組一般情況的各項指標差異均無統計學意義（P>0.05），模型組及各治療組24 h尿蛋白量、血糖及右腎指數均升高，體重均降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組相比，西藥組與壯通飲低劑量組、中劑量組、高劑量組各組24 h尿蛋白量、血糖及右腎指數均有所改善，差異有統計學意義（P<0.05）；而體重雖有所改善，但差異無統計學意義（P>0.05）。且各治療組之間，24 h尿蛋白量、血糖、體重、右腎指數差異均無統計學意義（P>005）。其原因可能與DN大鼠治療時間短等因素有關。見表1。

表1壯通飲（ZTY）對DN大鼠24 h尿蛋白量、血糖、體重、右腎指數的影響（±s）

組別n24 h尿蛋白量（g/24h）血糖（mmol/L）體重（g）右腎指數（mg/g）空白組1020.18±9.386.29±0.38432.80±71.192.00±0.83假手術組1421.76±7.225.91±0.50446.21±88.232.22±0.45模型組1459.60±25.82a24.87±3.26a276.50±30.22a5.53±0.67a西藥組1340.95±5.67ab18.88±5.62ab311.38±43.63a3.86±1.49abZTY（低）1039.55±7.10ab20.11±4.87ab286.50±62.19a3.62±1.08abZTY（中）1038.65±6.05ab19.13±7.82ab305.30±37.84a3.42±1.16abZTY（高）1040.97±7.65ab20.18±5.55ab296.80±45.15a3.69±1.05ab注：各組與空白組相比，aP<0.01；各治療組與模型組相比，bP<0.05。

2.3壯通飲對DN大鼠腎小球病理改變的影響光鏡下：空白組與假手術組大鼠，HE染色見腎小球結構清楚，基底膜完整，系膜區無增生，毛細血管腔開放性良好；PAS染色見腎小球內紅染物質均勻分布。模型組大鼠，HE染色見腎小球明顯肥大，基底膜增寬，系膜區明顯增生，毛細血管腔明顯變窄；PAS染色見腎小球內陽性物質明顯增多，系膜基質明顯增多，腎小球內毛細血管呈節段性硬化，毛細血管管腔狹窄。各治療組相對模型組，HE染色見腎小球內病變均有所減輕，PAS染色見腎小球內陽性物質均有不同程度的減少，腎小球內毛細血管節段性硬化病變均有不同程度的減輕，病變的腎小球數量均有不同的減少，其中壯通飲中劑量組減輕程度最為明顯。見圖1A～G、圖2A～G。電鏡下：空白組與假手術組大鼠腎組織足細胞的足突排列整齊、分布均勻，附著于基底膜上；模型組大鼠足細胞的足突融合、消失，基底膜未見明顯增厚；各治療組相對模型組，其足細胞足突融合、消失均有所改善，其中壯通飲中劑量組改善最為明顯。見圖3A～G。

圖1各組大鼠腎組織HE染色（×400）。A：空白組；B：假手術組；C：模型組；D：西藥組；E：ZTY低劑量組；F：ZTY中劑量組；

G：ZTY高劑量組。

圖2各組大鼠腎組織PAS染色（×400）。A：空白組；B：假手術組；C：模型組；D：西藥組；E：ZTY低劑量組；F：ZTY中劑量組；

G：ZTY高劑量組。

圖3各組大鼠足細胞TEM觀察（×10 000）；A：空白組 ；B：假手術組；C：模型組；D：西藥組；E：ZTY低劑量組；F：ZTY中

劑量組；G：ZTY高劑量組。

3討論DN發病機制十分復雜，迄今尚未完全闡釋清楚。目前對其機制的研究，大多從腎臟血流動力學改變、非酶糖基化、氧化應激、多元醇通路的激活、細胞因子等方面進行[5]。其臨床表現為早期腎小球濾過率升高，出現一過性微量蛋白尿，轉為中后期持續性大量蛋白尿、水腫、腎功能進行性減退甚至衰竭。而出現這些臨床表現，大多是由于腎臟體積增大、腎小球濾過屏障損害、腎小球硬化等腎臟病理學改變引起。

在腎小球超微結構中，足細胞是一種終末分化上皮細胞，無再生功能，為腎小球濾過屏障之一。足細胞損傷在DN發生發展中起到關鍵作用，與蛋白尿的產生和腎小球硬化的發生關系密切[6]。血糖升高為糖尿病的主要臨床表現，也是引起DN的最主要原因。高血糖可以通過激活PI3K/Akt通路導致足細胞內Ⅳ型膠原的表達，介導足細胞損傷[7]。足突為足細胞標志性特征，足突的融合、消失是足細胞損傷的最后通路[8]。因此改善足突融合、消失的改變，可以減輕足細胞損傷。

壯通飲為壯醫傳統經驗方，用藥精專，配伍嚴謹，已有研究發現本方有利于保護和延緩DM腎臟及心血管并發癥的進展[9]。本實驗研究進一步發現，壯通飲可以改善DN大鼠24 h尿蛋白量、血糖、右腎指數及體重等一般情況，減輕腎小球病理改變，并有利于改善足突融合、消失，從而減輕足細胞的損傷，對DN大鼠的腎臟具有一定保護作用，為臨床應用壯通飲防治DN提供理論基礎。參考文獻[1] 王海鵬，孟慶躍.2000—2009年我國成年人診斷糖尿病流行趨勢分析[J].中國預防醫學雜志，2013，14（2）：132135.

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（收稿日期：2015-01-14修回日期：2015-01-31）

（編輯：梁明佩）endprint