膠東半島地區雞源空腸彎曲桿菌毒力基因攜帶狀況調查

翟海華 ，王 娟，蓋文燕，黃秀梅，曲志娜，王君瑋，常維山

（1.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安271018 ；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266032）

空腸彎曲桿菌是全球范圍內引起人類腹瀉的主要細菌性病原菌之一，是一種人獸共患病病原菌?？漳c彎曲桿菌可在多種家禽、家畜和野生動物的腸道內定植，特別是禽類，所以這些動物都是潛在的感染源，家禽被認為是感染人類的最主要的來源[1]。被污染的食物和水以及與動物的直接接觸都是傳播空腸彎曲桿菌的主要途徑?？漳c彎曲桿菌的致病機制包括粘附、趨化、定植、侵襲,產生毒素以及與致病相關的分泌蛋白等，雖然人們對本菌的發病機制還并不明確,但研究證實毒力基因是主要的致病因素。為了解膠東半島地區空腸彎曲桿菌的分布、毒力因子的流行情況，本試驗對膠東半島地區不同來源的禽源空腸彎曲桿菌進行了分離鑒定，并選擇了與上述致病機制相關的14 種毒力基因，合成了相應的引物，進行毒力基因的檢測，為分析菌株之間的差異以及細菌可能的致病力提供了線索。

1 材料與方法

1.1 培養基及主要試劑 Cary-Blair 氏運送培養基（北京陸橋生物技術有限責任公司），空腸彎曲桿菌選擇性瓊脂基礎以及配套試劑（Sigma 公司，哥倫比亞血瓊脂基礎培養基（OXOID公司）；2×TaqPCR Master Mix（Promega 公司），DNAMarker DL-2 000[TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司]；新鮮綿羊血，氧化酶試紙，3%過氧化氫酶試劑，1%馬尿酸鈉，茚三酮（青島海博生物科技公司）；API Campy Kit（法國生物梅里埃公司）。

1.2 樣品來源 共238 份樣品，均來自膠東半島地區。其中2 個市場上出售活雞的泄殖腔拭子20份，2 家大型禽屠宰場雞盲腸樣品66 份，3 家養雞場泄殖腔拭子152 份。

1.3 試驗菌株 空腸彎曲桿菌標準菌株（ATCC3 3560），結腸彎曲菌，大腸桿菌，鼠傷寒沙門菌，金黃色葡萄球菌，糞腸球菌，阪崎腸桿菌的標準菌株均由中國動物衛生與流行病學中心動物產品安全監測室保存。

1.4 樣品采集與運送 養雞場和活禽市場：采集被檢雞的泄殖腔拭子，共采集泄殖腔拭子樣品172 份。屠宰場：屠宰線上采集雞盲腸段,共采集盲腸樣品66 份。所有樣品采集后均置于備有冰袋的泡沫盒中盡快運送至實驗室。

1.5 細菌分離與鑒定

1.5.1 細菌分離與純化 泄殖腔拭子直接劃線接種于空腸彎曲桿菌選擇培養基。對盲腸樣用接種環勾取少量盲腸盲端內容物，劃線接種于空腸彎曲桿菌選擇培養基上。將劃好的培養基放入厭氧培養盒內,加上微需氧產氣袋,密封后42 ℃培養36～48 h。挑取疑似菌落接種于哥倫比亞血平板進行純化，純化2～3 代，對純化好的菌株進行血清保存。

1.5.2 模板制備 采用煮沸法提取模板：用接種環挑取哥倫比亞培養基上的適量菌落于500 μL滅菌的蒸餾水中,渦旋混勻，12 000 r/min 離心5 min，移去上清；再加入200 μL 滅菌水，吹打混勻，放入100 ℃水浴鍋內作用10 min；取出立即冰浴5～10 min，12 000 r/min 離心5～10min,取上清于新的1.5 mL 離心管中，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.5.3 菌株初步鑒定 對可疑菌落進行革蘭染色、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗和馬尿酸鈉水解試驗,按照GB/T 4789.9-2003 進行菌株的鑒定。符合條件的菌株進一步用API 試劑盒進行空腸彎曲桿菌的鑒定，根據API 判定標準進行結果判讀。

1.5.4 PCR鑒定 參照Van 等[2]的方法選擇16SrRNA基因設計合成引物，片段大小為733 bp。PCR反應體系（25 μL）:2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.5 μL，上下游引物各0.5 μL，雙蒸水9 μL。循環參數優化為：94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環，72 ℃延伸7 min。將PCR 產物于1.2%瓊脂糖（0.5×TBE）進行凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色后，在凝膠成像儀上觀察結果。試驗以空腸彎曲桿菌ATCC33560為陽性對照，其他非空腸彎曲桿菌為陰性對照。

1.6 毒力因子檢測

1.6.1 引物設計 基因cadF和cdtC引物根據Bang[3]等的試驗方法，基因flaA和racR引物是根據薛峰[4]等介紹的方法，其他10種毒力基因引物是根據GenBank公布的基因序列設計的，引物序列、片段大小和退火溫度，見表1。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.6.2 毒力基因擴增 經PCR鑒定為空腸彎曲桿菌陽性的模板,進行相應毒力基因的擴增。反應體系為25 μL體系:2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.5 μL，上下游引物各0.5 μL，雙蒸水9 μL。PCR擴增條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，43 ℃～56 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環，72 ℃延伸7 min。擴增結束后，取5 μL PCR 擴增產物進行電泳,置于凝膠成像系統獲取圖像并分析電泳結果。PCR產物膠回收后，采用PCR 產物直接測序方法進行測序。

表1 毒力基因PCR 引物

2 結果

2.1 菌株鑒定

2.1.1 初步鑒定 在空腸彎曲桿菌選擇性培養基上可疑菌落呈灰白色或淺紅色，半透明，扁平濕潤有光澤,有呈沿接種線向外擴散的趨勢。革蘭染色為陰性，鏡檢呈逗點狀，若菌體相連，呈螺旋形或海鷗形。凡是鏡檢符合彎曲桿菌形態特征，氧化酶試驗陽性,過氧化氫酶試驗陽性，馬尿酸鹽水解試驗陽性的可疑菌再進行API 鑒定，根據標準判讀培養結果。

2.1.2 PCR 鑒定 利用所建立的方法,對分離到的可疑菌株進行PCR 鑒定，結果238 份采集的樣品中共分離到107 株空腸彎曲桿菌，分離率為45%，PCR 結果見圖1。

圖1 空腸彎曲桿菌PCR 檢測結果

表2 空腸彎曲菌分離結果

2.2 毒力基因檢測結果 14 種空腸彎曲桿菌毒力基因PCR 擴增產物結果見圖1，以空腸彎曲桿菌參考菌株作對照，并對PCR 產物進行測序，經比對PCR 產物是目的基因產物。空腸彎曲桿菌分離株各個毒力基因的檢出率如圖3 所示。針對所檢測的14 種毒力因子，107 株空彎分離株中有4 株含有全部14 種毒力因子，占總分離數的3.7%，39 株含有13 種毒力因子，占總數的36.4%，38 株含有12 種毒力因子，占總數的35.5%，23 株含有11 種毒力因子，占總數的21.5%，還有3 株含有10 種毒力因子，占總數的2.8%。

3 討論

娜仁高娃等[5]從700 多份新鮮雞糞樣品中共分離到空腸彎曲桿菌208 株，分離率為26.9%。陳荀等[6]從養殖場和屠宰場雞糞樣品中分離率為74.29%和66.38%。本次試驗對膠東半島地區市場、蛋雞養殖場和肉雞屠宰場的雞源空腸彎曲桿菌進行分離鑒定，平均分離率為45%。

目前對于空腸彎曲桿菌的致病機理不是十分明確，但許多研究已經證實毒力因子與細菌的毒力及致病能力相關。本試驗中選擇了目前國內外研究較多的14 種毒力相關基因，對膠東半島地區107 株空腸彎曲桿菌分離株毒力相關基因的存在情況進行了調查分析。

圖2 空腸彎曲桿菌毒力基因PCR 檢測圖

鞭毛在空腸彎曲桿菌致病過程中起到提供動力和粘附作用，鞭毛蛋白基因flaA是重要的毒力因子，粘附蛋白PEB1 是主要的粘附因子。本試驗中flaA和peb1A的檢出率分別為100%和99.07%，與國內外研究報道一致。pldA基因編碼一種外膜磷脂酶A，在病菌入侵細胞時起作用，磷脂酶還和溶血活性有關[7]。侵入抗原蛋白基因ciaB是空腸彎曲菌最大限度入侵組織細胞所必需侵入抗原蛋白，racR基因是racRracS系統的一員，編碼調節蛋白在彎曲桿菌定植禽類腸道時起作用，cadF 基因編碼外膜蛋白與纖連蛋白結合，介導空腸彎曲桿菌與宿主腸上皮細胞。本試驗中pldA，ciaB，racR，cadF 的檢出率分別為100%，96.26%，97.20%和99.07%。細胞致死性膨脹毒素（CDT）基因cdtA，cdtB，cdtC的檢出率分別76.64%，100%和100%，在Hamidian[8]和張茂俊[9]等的研究中這3 種基因的檢出率都接近100%，而本結果cdtA的檢出率較低，原因需要進一步研究。趨化因子cheW，cheY 的檢出率為99.07%，98.13%，高檢出率說明趨化作用在空腸彎曲桿菌的致病過程中起到非常重要的作用。熱休克蛋白dnaK和grpE的檢出率為100%和71.96%。neuB1 基因決定了空腸彎曲桿菌LOS中唾液酸的合成與表達，本試驗中neuB1 檢出率為4.67%。

圖3 107株空腸彎曲桿菌毒力基因檢測結果

膠東半島地區雞源空腸彎曲桿菌毒力基因攜帶率較高，所分離到的菌株所攜帶的毒力基因數都超過10 種。感染宿主沒有臨床表現，可能本菌致病性與多種因素有關。菌株毒力基因高攜帶率說明具有潛在致病力，如果人們接觸到被污染的沒有加工成熟的食品，很容易造成感染，應加強各生產環節的安全控制，保證食品安全。國內對空腸彎曲桿菌毒力因子的研究報道還比較少，要加強空腸彎曲桿菌及其毒力基因的檢測，這對空腸彎曲桿菌病的防控具有重要意義。

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