miR-199在對(duì)順鉑敏感性不同的卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其意義

柳長(zhǎng)青，徐漢杰，周穎，趙衛(wèi)東

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.安徽省腫瘤醫(yī)院)

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·基礎(chǔ)研究·

miR-199在對(duì)順鉑敏感性不同的卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其意義

柳長(zhǎng)青1,3，徐漢杰1,2，周穎2，趙衛(wèi)東1,3

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.安徽省腫瘤醫(yī)院)

[摘要]目的探討miR-199在卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)，尋找卵巢癌化療敏感性的指標(biāo)。方法組學(xué)分析找出在順鉑敏感性不同的卵巢癌細(xì)胞株， miR-199的表達(dá)量差異較為顯著，qRT-PCR和western blot方法檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR199 mimic/antagomir后的卵巢癌細(xì)胞株,P63表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。結(jié)果miR-199在對(duì)順鉑耐藥的ES-2細(xì)胞中表達(dá)水平高于在對(duì)順鉑耐藥的SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)，miR-199的下游蛋白P63的表達(dá)也有差異。結(jié)論miR-199與P63在一定程度上可以預(yù)測(cè)卵巢癌順鉑化療敏感性， miR-199可能是通過(guò)其下游靶基因P63發(fā)揮其在卵巢癌順鉑化療敏感性中的作用。

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤；抗藥性，腫瘤；順鉑；紫杉酚；氟尿嘧啶

人們通過(guò)對(duì)癌癥耐藥機(jī)制的深入研究，漸漸認(rèn)識(shí)到卵巢癌的耐藥不僅與基因突變等遺傳學(xué)機(jī)制有關(guān)，也與表觀遺傳學(xué)異常密切相關(guān)[1-4]。近幾年來(lái)，DNA甲基化組學(xué)、mRNA組學(xué)以及蛋白組學(xué)的不斷研究發(fā)展，更為檢驗(yàn)出與癌癥相關(guān)異常表達(dá)的因子提供了方便[3]。此次研究中，我們借助組學(xué)分析及qRT-PCR等技術(shù)手段分析miR-199在順鉑敏感度差異性較大的SKOV3和ES-2卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，為尋找預(yù)測(cè)卵巢癌化療敏感性指標(biāo)及耐藥機(jī)制提供新的方向。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系ES-2(上海細(xì)胞庫(kù)：NO.C0585)COC1(北京腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)：NO.HB-5606)COC2(北京腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)：NO.HB-5607)，SKOV3和HO8910均來(lái)自安徽省立醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2化療藥物紫杉醇注射液(paclitaxel，北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,上海旭東海普藥業(yè)有限公司)，順鉑注射液(cisplatin，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)，注射用奈達(dá)鉑(nedaplatin，江蘇奧康賽藥業(yè)股份有限公司)，多西他賽注射液(docetaxel，江蘇奧康賽藥業(yè)股份有限公司)，注射用絲裂霉素(mitomycin，浙江海正藥業(yè)股份有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系在含10%胎牛血清的雙抗(100 u/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qRT-PCRTRIzol法提取細(xì)胞的總RNA，無(wú)RNA 酶的DNA 酶I處理RNA 中污染的DNA，樣品經(jīng)過(guò)酚和氯仿抽提后，溶解于DEPC 處理的水中，提取的細(xì)胞總RNA 5 ug與1 μL 100mM Oligo(dT)，1 uL 10mM dNTPs混合，65 ℃加熱5 min后，立即冰上放置5 min。在冰上預(yù)冷RNase free反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積25 μL。混勻，離心后在室溫下反應(yīng)1 h，接著85℃ 10 min 滅活處理。樣品儲(chǔ)存于-20 ℃。用SYBR?PCR分析儀對(duì)RNA水平進(jìn)行檢測(cè)。P63引物信息如下表1。

表1　P63引物信息

1.2.3Western blot 細(xì)胞收蛋白，定量蛋白用SDS-polyacrylamide gel分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。一抗(1:500)過(guò)夜，加二抗，1 h后HRP化學(xué)發(fā)光、顯影。GAPDH作為內(nèi)參。Tanon 6200顯影拍照。顯影圖片用Smartview分析軟件進(jìn)行密度分析掃描。

1.2.4核酸的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(Lipofectamine 2000)(1)轉(zhuǎn)染前1天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%~95%。細(xì)胞鋪板在2 mL雙無(wú)DMEM培養(yǎng)基中。(2)對(duì)于每孔細(xì)胞，使用250 μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋4.0 μg DNA，輕輕混勻。(3)使用前將Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻，用250μL DMEM培養(yǎng)基稀釋10 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。Lipofectamine 2000稀釋后，在5 min內(nèi)同稀釋的DNA混合。(4)混合稀釋的DNA(第2步)和稀釋的Lipofectamine 2000(第3步)。室溫放置20 min。棄液，無(wú)血清培養(yǎng)基清洗2次。(5)直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37 ℃，5%CO2中保溫4~6 h后，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2結(jié)果

2.1IC50值的比較SKOV3和ES-2細(xì)胞對(duì)順鉑(DDP)敏感性差異最大(IC50比值=124.52，圖1)；其他幾種化療藥物的敏感性差別較小：IC50比值較低，分別為紫杉醇(4.25)，5-氟尿嘧啶(1.96)，奈達(dá)鉑(2.12)，絲裂霉素(2.44)和多西他賽(25.34)。IC50相對(duì)數(shù)值見(jiàn)表2。

表2　化療藥物在卵巢細(xì)胞的相對(duì)IC50值

2.2化療敏感性不同的卵巢癌細(xì)胞間的miR差異性表達(dá)miRNA表達(dá)譜的測(cè)序結(jié)果顯示miR-199在COC1、COC2和ES-2細(xì)胞表達(dá)高于SKOV-3中的表達(dá)：分別為955,377,1245和70，差異顯著(見(jiàn)圖2)。相反，我們另外設(shè)置一個(gè)作為對(duì)照的無(wú)關(guān)miRNA，即miR-127-3p，它在各個(gè)卵巢癌細(xì)胞系中的resds值很低，且無(wú)差異。

2.3miR-199在SKOV3和ES-2細(xì)胞系中的表達(dá)情況qRT-PCR檢測(cè)miR-199在ES-2、SKOV-3卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)設(shè)miR-199在SKOV3相對(duì)表達(dá)水平為1.00，則ES-2的表達(dá)水平為5.27(P=0.024)，與miR表達(dá)譜的測(cè)序的結(jié)果一致(見(jiàn)圖2，圖3)。

2.4miR-199下游基因P63在SKOV3和 ES-2細(xì)胞系中的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示P63在SKOV3中的表達(dá)水平高于在ES-2細(xì)胞中(見(jiàn)圖4)。在SKOV3和ES-2卵巢癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miR-199-mimic/antagomir后檢測(cè)P63的mRNA及蛋白表達(dá)水平。

qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-199 mimic的SKOV3細(xì)胞中，P63的mRNA水平是降低的(ABCC8不是miR-199的靶基因，作為第二內(nèi)參)，轉(zhuǎn)染miR-199 antagomir的ES-2細(xì)胞，其mRNA表達(dá)水平升高(見(jiàn)圖5)。可以看出，人為地改變miR-199地水平對(duì)于P63地mRNA水平有影響，但是不能改變ABCC8的mRNA水平。

Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-199 mimic的SKOV3細(xì)胞中，P63的相對(duì)表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染miR-199 antagomir的ES-2細(xì)胞，P63的表示水平則增高(見(jiàn)圖6)。結(jié)合上述結(jié)果，說(shuō)明P63基因直接受到miR-199的調(diào)控，是miR-199的靶基因。

3討論

目前，臨床上缺乏有效預(yù)測(cè)卵巢癌對(duì)于化療藥物敏感性方法，使得盲目和過(guò)度化療在所難免。因此，考慮到能夠發(fā)現(xiàn)有效預(yù)測(cè)化療耐受性的分子標(biāo)記是迫切需要解決的，基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究越來(lái)越備受關(guān)注。在分子水平上，國(guó)內(nèi)外科研人員發(fā)現(xiàn)了許多可作用于卵巢癌發(fā)病機(jī)制的通路和基因[5]。其中，miRNA的眾多下游基因的表達(dá)調(diào)控與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展以及耐藥性有一定關(guān)系[6]。

miRNAS是調(diào)節(jié)目的基因轉(zhuǎn)錄后的非編碼RNA，在廣泛的物種中狀態(tài)穩(wěn)定，通常參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。miRNAS通過(guò)綁定特定的3′-UTR區(qū)來(lái)負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)。由于miRNA不需要特異性的結(jié)合位點(diǎn)和識(shí)別短小片段來(lái)擴(kuò)展5′-seed區(qū)域，一個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)以百計(jì)個(gè)miRNAs，多個(gè)miRNAs同樣也可以共同調(diào)控一個(gè)miRNA[7]。miRNAs預(yù)計(jì)監(jiān)管大約60%的人類(lèi)基因，參與基因的調(diào)控作用，如發(fā)生發(fā)展、分化、代謝、增殖、細(xì)胞周期、炎癥和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)[8]。目前，眾所周知miRNAs在癌癥中可以上調(diào)和下調(diào)。超表達(dá)的miRNAS可下調(diào)腫瘤抑制基因的表達(dá)，而表達(dá)下調(diào)的miRNAS可作為腫瘤抑制因子負(fù)調(diào)節(jié)致癌基因[9]。Let-7家族在各種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，從而作為腫瘤抑制因子出現(xiàn)[10]。miR-15和miR-16的靶基因BCL2是一種致癌基因，下調(diào)BCL2會(huì)導(dǎo)致白血病細(xì)胞的凋亡[11]。也有一些證據(jù)證明miR-199負(fù)調(diào)控其下游靶基因?qū)е履[瘤細(xì)胞耐藥性的改變，但是其作用還有待于進(jìn)一步研究[12]。以上研究結(jié)果只代表一小部分科研人員強(qiáng)調(diào)miRNAS在各種惡性腫瘤以及癌癥生物學(xué)中的作用。

為了闡述卵巢癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制，我們對(duì)5種卵巢癌細(xì)胞系分別進(jìn)行6種臨床常見(jiàn)化療藥物進(jìn)行敏感性實(shí)驗(yàn)分析。通過(guò)測(cè)得每種細(xì)胞的IC50值，我們發(fā)現(xiàn)SKOV3和ES-2兩株細(xì)胞系對(duì)順鉑的敏感性相對(duì)其他株細(xì)胞系，具有顯著的差異。我們猜想對(duì)同一種藥物有如此明顯差異的兩株細(xì)胞系，其內(nèi)必有導(dǎo)致產(chǎn)生這種現(xiàn)象的非人為因素，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

由于miRNA的眾多下游基因的表達(dá)調(diào)控與卵巢癌的耐藥性有一定關(guān)系，且參與卵巢癌耐藥性的基因受到miRNA的調(diào)節(jié)，例如：miR-29轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)DMNT3B的表達(dá)[9]。因此，我們從該調(diào)控機(jī)制出發(fā)，研究卵巢癌細(xì)胞系對(duì)DDP耐藥性的機(jī)制，希望找出新的可以指導(dǎo)臨床的耐藥機(jī)制。我們分析比較了SKOV3和ES-2的miR表達(dá)譜式，篩選出幾十個(gè)表達(dá)差異明顯的miR，其中我們選擇了差異性最為明顯的miR-199來(lái)進(jìn)行研究。

我們用Solexa二代深度測(cè)序技術(shù)繪制4種卵巢癌細(xì)胞系：COC1、COC2、SKOV3和ES-2的miR表達(dá)譜，在有差異性表達(dá)的數(shù)十個(gè)miR中，miR-199的表達(dá)水平與卵巢癌細(xì)胞系的順鉑化療敏感性相關(guān)性尤為緊密。接著我們通過(guò)qRT-PCR復(fù)測(cè)miR-199在順鉑敏感性差異較大的兩株卵巢癌細(xì)胞系的表達(dá)情況，其表達(dá)水平與miR表達(dá)譜的測(cè)序結(jié)果一致，miR-199的表達(dá)高低與卵巢癌的順鉑的敏感性密切相關(guān)。

眾多研究報(bào)道，P63的生物學(xué)功能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位[8,13]，尤其是參與細(xì)胞凋亡方面，考慮到凋亡蛋白與化療藥物敏感性之間的關(guān)系，我們猜想P63的表達(dá)改變或許就是影響卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的“鑰匙”。接著我們通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)和相關(guān)網(wǎng)站搜索，發(fā)現(xiàn)P63在SKOV3和ES-2中的蛋白表達(dá)趨勢(shì)與理論預(yù)測(cè)相符合，猜想P63與miR-199具有一定的相關(guān)性。接著，我們瞬轉(zhuǎn)miR-199 mimic到SKOV3細(xì)胞中，P63的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低；而瞬轉(zhuǎn)miR-199 antagomir到ES-2細(xì)胞中，P63的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上揚(yáng)，進(jìn)一步證實(shí)了猜想的準(zhǔn)確性。至此，我們的研究基本確定了miR-199負(fù)調(diào)控其下游靶基因P63參與卵巢癌順鉑耐藥性的改變，但是除了P63基因外，也許還有其它miR基因參與調(diào)控，這些將是我們下一步需要考慮研究的方向。

(本文圖1~6見(jiàn)插圖3-1)

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The expression and significance of miR-199 in ovarian cancer cell lines

LiuChangqing*,XuHanjie,ZhouYing,ZhaoWeidong

(*AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

[Abstract]ObjectiveIn this study,we aimed to detect the expression of miR - 199 and searched for chemotherapy sensitivity of indicators in ovarian cancer cell lines and.Methods Omics analysis had found that in ovarian cancer cell lines which had different sensitivities to cisplatin,the difference of expression of miR - 199 is significant.Then used specificity methylation PCR and western blot to verify the expression level of P63 gene in ovarian cancer cell lines of the transient transfection miR199 mimic/antagomir.ResultsThe expression level of miR-199 in ES-2 is much higher than in the expression of SKOV3 cells.The expression of p63 is negatively correlated with the expression of miR-199.ConclusionsmiR-199 and P63 may predict the sensitivity to cisplatin chemotherapy to some extent.miR-199 may effect the sensitivity to cisplatin chemotherapy of ovarian cancer by regulating its downstream target genes P63.

[Key words]Ovarian neoplasms；Drug resistance，neoplasm；Cisplatin；Paclitaxel；Fluorouracil

(收稿日期:2015-04-22)

Corresponding author:Zhao Weidong,Email：victorzhao@163.com

通信作者：趙衛(wèi)東，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email:victorzhao@163.com

作者簡(jiǎn)介：柳長(zhǎng)青，碩士在讀，Email：aydlcq@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81272881)；安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(08010302101)

中圖分類(lèi)號(hào)：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.03.021