ApoG2聯合放療對鼻咽癌CNE-2細胞自噬 與凋亡的影響研究

劉洋，劉碩，孫建軍

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論著·基礎

ApoG2聯合放療對鼻咽癌CNE-2細胞自噬 與凋亡的影響研究

劉洋，劉碩，孫建軍

目的 探討ApoG2聯合放射治療對鼻咽癌(NPC)的CNE-2細胞自噬與凋亡的影響。方法 將人NPCCNE-2細胞株分成空白對照組(僅加培養液，不加細胞)、放射治療組、ApoG2組、聯合組(放射+ApoG2)，采用CCK-8法測定ApoG2+放射治療對細胞增敏的作用，Hoechst33258染色觀察細胞凋亡形態的變化，吖啶橙染色觀察細胞自噬形態變化，檢測細胞凋亡率的變化；Westernbolt檢測Beclin1、Bcl-2蛋白的表達情況變化。結果 不同的放射劑量組間細胞增殖抑制率比較具有顯著性差異(P<0.01)，隨著放射劑量的增加，鼻咽癌CNE-2細胞的抑制率也隨之上升；不同的ApoG2藥物濃度組間細胞增殖抑制率比較差異也具有顯著性意義(P<0.01)，隨著藥物濃度的增加，鼻煙癌CNE-2細胞的抑制率也上升。4組CNE-2細胞的凋亡率組間比較具有顯著性差異，聯合組凋亡率顯著高于其他3組(F=140.2，P<0.01)。4組的Bcl-2、Beclin1的蛋白表達量組間比較差異具有統計學意義(Bel-2：F=71.24，P<0.01；Beclinl：F=107.53，P<0.01)，其中聯合組的Bcl-2蛋白表達量最低，Beclin1的蛋白表達量最高。結論ApoG2聯合放療能夠通過誘導鼻咽癌CNE-2細胞的自噬與凋亡，從而抑制CNE-2細胞的增殖。

ApoG2；鼻咽癌；CNE-2細胞；自噬；凋亡

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.016

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是發生于上咽喉部或鼻咽腔的一種惡性腫瘤，對我國人民的生命健康構成了嚴重的威脅。由于其解剖學特點和生物學行為比較特殊，對放射線較為敏感，故其主要的治療手段是放射治療[1，2]。化療藥物大多數是通過對腫瘤細胞進行誘導使其發生凋亡達到治療腫瘤的目的，目前有研究顯示在治療腫瘤的過程中自噬也扮演著重要的角色[3]。ApoG2(apogossyplone)作為小分子B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma，Bcl-2)的抑制劑，是新型的棉酚衍生物之一，在多種腫瘤的治療中表現出了良好的治療效果[4]。本文旨在通過對ApoG2聯合放射治療對NPC的CNE-2細胞增殖的抑制作用，探討此種治療手段對細胞自噬與凋亡的影響，給臨床治療NPC提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人NPC CNE-2細胞株： 由中國醫科大學腫瘤研究所提供。將人NPC CNE-2細胞株分成空白對照組(僅加培養液，不加細胞)、放射治療組、ApoG2組、聯合組(放射+ ApoG2)。

1.1.2 主要試劑： ApoG2(美國密歇根大學醫學院)配成20 mmol/L母液于-20℃中避光保存，25 cm2和75 cm2的培養瓶，6、9孔板，15 ml和50 ml的離心管(Corning公司)，PBS溶液、0.25%胰蛋白酶溶液(含EDTA)(HyClon公司)，H-DMEM高糖培養液(HyClon公司)，胎牛牛血清(杭州四季青公司)，1×青鏈霉素(廣州捷倍斯生物科技有限公司)，Hoechst 33258染色試劑盒、CCK-8溶液(碧云天生物技術有限公司)，細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物產品)，BCA、PMSF、RIPA蛋白定量試劑盒(上海申能博彩生物公司)，預染蛋白Marker(Fermentas公司)，5×上樣緩沖液(碧云天生物技術有限公司)，beta-actin(上海艾比瑪特公司)，抗Bcl-2抗體、抗Beclin1抗體(Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶二抗(武漢博士德公司)，PVDF膜(Millipore公司，美國)，ECL發光液(碧云天生物技術有限公司)。

1.1.3 主要設備： X膠片(柯達公司)，定影粉、顯影粉(廣州威佳科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養： (1)細胞復蘇。解凍人NPC CNE-2細胞株凍存管，移至無菌操作臺，將細胞放置離心管內，注入5 ml含1×青鏈霉素、10%滅活胎牛血清的H-DMEM培養液內，將細胞輕輕吹打和洗滌，離心后將廢液除去；重懸細胞后移入培養瓶內，放置于培養箱內培養。(2)細胞的傳代和培養。對人NPC CNE-2細胞的貼壁情況進行觀察，每3天換1次液，若培養瓶底80%～90%被細胞長滿時進行傳代培養，即先將培養液吸去，洗滌后加入0.25%的胰蛋白酶溶液(含EDTA)，將瓶底鋪滿，在培養箱內孵育、消化5～7 min，取出置于顯微鏡下，對細胞形態進行詳細觀察。大量細胞一旦變圓時，為了終止細胞消化注入培養液，然后將細胞懸液離心，除去廢液，重懸細胞，最后按照1∶4～1∶5進行細胞的傳代處理。

1.2.2 細胞增殖抑制測試： 采用CCK-8法測定,消化對數生長期細胞CNE-2，計數后重懸細胞，接種于96孔的培養板，消化后將細胞濃度調整為5×104個/ml，接孔，每孔注入100 μl的細胞懸液。培養后將舊培養液吸盡，分成空白對照組(僅加培養液，不加細胞)、放射治療組、ApoG2組、聯合組(放射+ ApoG2)，每組平行復孔4個。分別培養后將舊培養液吸盡，將新培養液注入，同時注入10 μl的CCK-8溶液，于培養箱內孵育。在450 nm波長下用酶標儀測定各孔的吸光度A值，反復3次，依據抑制率(%)=1-(實驗組平均A值-空白對照組的A值)/(對照組平均A值-空白對照組的A值)×100%，計算各組的增殖抑制率。

1.2.3 觀察細胞凋亡、自噬形態變化： Hoechst 33258染色觀察聯合治療下細胞凋亡形態的變化和吖啶橙染色對聯合治療下細胞自噬形態的變化。消化、重懸對數生長期細胞CNE-2，計數后依據1.5×105個/孔接種至6孔板中，培養瓶底長滿50%～70%的細胞后將舊培養液吸盡，分為對照組(0.01%DMSO)，放射治療組(4 Gy)，ApoG2組(20 μmol/L)，聯合組(放射治療+ApoG2)。將100 μl的培養液加入每組中，聯合組及放射治療組照射4 Gy。培養后將舊培養液吸盡，加入固定液0.5 ml，均勻覆蓋孔板底，洗滌后將廢液吸盡，加入Hoechst 33258染色液0.5 ml/1.0 mg-1·L-1吖啶橙染色，避光5 min/15 min后將廢液吸盡，在陰涼避光下保存，反復3次于顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態。

1.2.4 Western bolt蛋白印跡法檢測聯合治療下Beclin 1、Bcl-2蛋白的表達變化： 依據上述的分組情況，待培養瓶底長滿50%～70%的細胞后將舊培養液吸盡，將100 μl的培養液加入每組中，聯合組及放射治療組照射4 Gy。培養、收集以及冰上裂解細胞后，將總蛋白收集，采用BCA法測定蛋白的濃度。用12%的SDS-PACE將蛋白分離，15 V半干轉膜儀，1 h后轉至PVDF上，封閉1 h后洗膜，加入已經稀釋過的Bcl-2、Beclin1、β-actin多克隆抗體，再次封閉、洗膜，用稀釋過的辣根過氧化物酶二抗進行1 h的反應后洗膜，顯影定影后，分析結果。

2 結 果

2.1 各組鼻咽癌CNE-2細胞增殖抑制率的比較 不同的放射劑量組間比較差異具有統計學意義(P<0.01)，隨著放射劑量的增加，鼻咽癌CNE-2細胞抑制率也隨之上升。不同的ApoG2藥物濃度組間比較差異也具有統計學意義(P<0.01)，隨著ApoG2濃度逐漸增加，鼻咽癌CNE-2細胞抑制率也隨之升高。見表1。

表1 ApoG2聯合放療對于CNE-2的生長抑制率 (%)

2.2 各組鼻咽癌CNE-2細胞凋亡率的比較 結果提示4組CNE-2細胞的凋亡率組間比較差異具有統計學意義(F=140.2，P<0.01)，聯合組CNE-2細胞凋亡率顯著高于其他3組(P<0.01)。見表2。

表2 各組鼻咽癌CNE-2細胞凋亡和自噬的比較±s)

2.3 各組細胞自噬的比較 各組的Bcl-2、Beclin1的蛋白表達量組間比較差異具有統計學意義(F=71.24，F=107.53，P均<0.01)，其中聯合組的Bcl-2蛋白表達量最低，Beclin1的蛋白表達量最高。見表2，圖1。

圖1 各組Bcl-2、Beclin 1及β-actin蛋白表達比較

3 討 論

據相關研究資料顯示，細胞自噬和凋亡間的相互作用能共同對細胞的死亡起促進作用。Bcl-2蛋白是對細胞凋亡起主要調控作用的蛋白，其過表達可以對細胞自噬的發生起有效地抑制作用[5]。其既可以對凋亡進行誘導，也能對自噬構成影響。其中Bcl-2蛋白引發的自噬與Beclin1蛋白可能相關。Beclin1蛋白存在BH3的結構域，類似BH3的物質可以競爭性地對抗Bcl-2與Beclin間的結合，可以釋放出Beclin1來促進細胞的自噬。Bcl-2與Beclin間的結合能對乳腺癌細胞株MCF-7細胞具有的自噬能力進行有效的抑制，但是突變型的Beclin1無法與Bcl-2蛋白結合，增強了細胞的自噬，加快了細胞的凋亡過程[6，7]。

本研究結果發現，在體外運用ApoG2作用于NCLCNE-2細胞后，可以對細胞的生長進行有效地抑制，明顯表現為劑量—時間的依賴性，抑制作用隨著劑量的上升而增強，隨著作用時間的延長而增強。此外體內試驗結果也顯示，當注射ApoG2第12天時將試驗終止，腫瘤剝離，腫瘤稱量結果提示腫瘤受到明顯的抑制，提示無論體內還是體外應用ApoG2均可以對NCLCNE-2細胞有顯著的抑制效果[8]。

本實驗通過蛋白印跡法發現ApoG2可以引發Bcl-2表達的下調，進而誘導CNE-2細胞的凋亡，同時上調的Beclin1引發了自噬[9]，此與上述的結果相符。本實驗結果表明，對于CNE-2細胞，放射治療與ApoG2以及其聯合作用，不同放射劑量間的比較具有顯著的統計學差異，其對NPCCNE-2細胞的抑制率隨著放射劑量的上升而上升。ApoG2的藥物濃度不同，其之間的差異同樣具有統計學意義，對應的抑制率也隨著ApoG2藥物濃度的增加而上升[10]。這2個結果間有著一定的交互效應，即在放射劑量不同的情況下，抑制率隨著ApoG2藥物濃度的增加而增強[11]；在ApoG2藥物濃度不同的情況下，抑制率同樣隨著放射劑量的上升而增強。ApoG2是能夠對腫瘤進行有效抑制的一種藥物。通過蛋白印跡法發現Bcl-2蛋白的相對表達率有所降低，其中聯合組的表達量最低；Beclin1蛋白的相對表達量上升，而聯合組中最高。ApoG2可以促進放療治療對NCL的敏感性，可能的機制與下調的Bcl-2蛋白表達對細胞凋亡進行誘導，上調的Beclin1蛋白對細胞自噬進行誘導相關。在細胞的凋亡與自噬中，Beclin1蛋白起著重要的作用，其存在BH3結構域，類似BH3的物質可以競爭性地對抗Bcl-2與Beclin1的結合[12]。

總之，ApoG2可以協同增加放射治療對NCL的敏感性，對NCL的生長進行有效地抑制，通過上調Beclin1蛋白的表達量以及下調Bcl-2蛋白的表達量對細胞的自噬與凋亡進行誘導，最終致使細胞死亡。

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The study of the effect of ApoG2 combined with radiotherapy onautophagy and apoptosis of CNE 2 cells of nasopharyngeal carcinoma

LIUYang,LIUShuo,SUNJianjun.

DepartmentofENT,theGeneralNavyHospital,Beijing100048,China

SUNJianjun,E-mail:jjsun85@sina.com

Objective To investigate the effect of ApoG2 combined with radiotherapy on CNE 2 cell autophagy and apoptosis in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods Human NPC CNE were divided into blank control group (only 2 cell lines with medium, without the addition of cells) and radiotherapy group, ApoG2 group, combination group (radiotherapy + ApoG2), to determine the treatment sensitizing effects on cell growth of ApoG2+ radiation by using the method of CCK was 8, Hoechst 33258 staining was used to observe the changes of cell apoptosis morphology of autophagy, observe the morphological changes of acridine orange staining; cell apoptosis rate changes were detected, Western bolt detection were used to detect the expression of Beclin1, Bcl 2 protein changes.Results There was significant difference of cell proliferation inhibition rate between different radiation dose group (P<0.01),withtheincreaseofradiationdoses,nasopharyngealcarcinomaCNE2cellinhibitionratealsoincreased;differentApoG2drugconcentrationgroupamongthecellproliferationinhibitionratealsohassignificantdifference(P<0.01),withtheincreaseofdrugconcentration,CNEinhibited2nasopharyngealcarcinomacellrateincreased. 4groups’CNE2cellsapoptosisrateofrevealedsignificantdifferenceswithingroups(F=140.2,P<0.01),apoptosisrateofcombinedgroupwassignificantlyhigherthantheother3groups(P<0.01). 4groupsofBcl2 (F=71.24,P<0.01),Beclin1 (F=107.53,P<0.01)proteinexpressionwasstatisticallysignificantdifferencesbetweengroups,thejointgroup’sBcl2proteinexpressionwasthelowest,theexpressionofBeclin1proteinwasthehighest.Conclusion ApoG2 combined with radiotherapy can through autophagy and apoptosis induction of nasopharyngeal carcinoma CNE 2 cell to inhibit the proliferation of CNE 2 cells.

ApoG2; Nasopharyngeal carcinoma; CNE2 cells; Autophagy; Apoptosis

100048 北京，解放軍海軍總醫院耳鼻喉科

孫建軍，E-mail:jjsun85@sina.com

2014-12-10)