橙皮素對轉化生長因子-β1誘導心肌成纖維細胞增殖的影響

胡哲夫，唐其柱，劉源，李金，張文斌

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論著·基礎

橙皮素對轉化生長因子-β1誘導心肌成纖維細胞增殖的影響

胡哲夫，唐其柱，劉源，李金，張文斌

目的 探討橙皮素(HES)對轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導心肌成纖維細胞增殖的影響，并探討其可能的機制。方法 取SD大鼠30只，取其心肌組織進行成纖維細胞的培養。而后采用TGF-β1(10ng/ml)刺激成纖維細胞，采用4種不同濃度梯度的HES(25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L)干預成纖維細胞24h，以臺盼藍染色檢測其對細胞活性的影響；熒光酶標儀檢測法用于檢測細胞內活性氧(ROS)的水平；活細胞計數試劑盒(CCK-8)用以檢測成纖維細胞的增殖情況。結果 臺盼藍染色結果提示，HES對成纖維細胞的細胞活性無顯著影響，各組活性值分別為空白對照組：100%，HES25μmol/L組:95%，HES50μmol/L組：94%，HES75μmol/L組: 93%，HES100μmol/L組:93%。酶標儀檢測結果表明，與空白對照組相比，TGF-β1可增加成纖維細胞內ROS的水平(P<0.01)，當HES與TGF-β1同時作用時，ROS水平隨著HES濃度的增加逐漸降低，均存在統計學意義(P<0.05)；TGF-β1可刺激成纖維細胞增殖(P<0.01)，當HES(100μmol/L)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)(1mmol/L)與TGF-β1同時作用時，可明顯抑制成纖維細胞增殖(P<0.01)。結論HES可通過抑制TGF-β1誘導的氧化應激進而抑制心肌成纖維細胞增殖，提示其對于預防心肌纖維化可能具有潛在效果。

橙皮素；轉化生長因子-β1；成纖維細胞；細胞活性

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.014

在心肌肥厚及心肌纖維化的過程中，常伴有成纖維細胞的過度增殖和膠原分子的大量分泌，而纖維化的持續進展會導致心肌收縮及舒張功能障礙，心律失常以及室壁順應性降低，最終可導致心力衰竭[1～3]。既往研究表明[4～6]，轉化生長因子-β1(TGF-β1)具有促進炎性反應、氧化應激、纖維化等作用，且TGF-β1可顯著促進成纖維細胞的增殖及細胞外基質的沉積。橙皮素(hesperotin,HES)是一種二氫黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制腫瘤生長、抗血小板聚集等多種生物學功效[7，8]，但其在心血管系統中研究尚少。因此本研究擬用TGF-β1刺激心肌成纖維細胞的增殖，并以HES干預，觀察HES是否對TGF-β1誘導的心肌成纖維細胞增殖產生影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 出生1～7 d的SPF級雄性SD大鼠30只,購自武漢大學動物實驗中心[動物合格證號:SCXK(鄂)2008-0004]，飼養于武漢大學人民醫院實驗動物中心SPF級動物室[使用許可證號：SYXK(鄂)2004-0027]。動物實驗的操作均參照美國《實驗動物管理和使用指南》， 且經過武漢大學人民醫院動物管理和使用中心的批準。試劑：橙皮素(上海融禾醫藥科技發展有限公司)，DMEM/F12培養基(上海立菲生物技術有限公司)，新生小牛血清(NCS)、雙抗(青霉素+鏈霉素)、0.125%胰蛋白酶消化液(美國Gibco公司)，TGF-β1(美國PEPROTECH公司)，2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(美國Sigma公司)、CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所本)。

1.2 成纖維細胞的獲得及培養 取 SD大鼠以75%的乙醇浸泡數秒，對其頸部以下消毒， 抓取小鼠，固定四肢，由頸部沿左鎖骨中線剪開胸腔，暴露心臟后將心臟完整剪下，置于已在冰臺上預冷的含有 DMEM/F12培養基和20% NCS的培養皿中，清洗2次后，將組織剪成約1 mm3大小，轉移至含有轉子的培養瓶中，加入0.125%的胰酶，在37℃恒溫磁力攪拌器中消化10 min后將里面的胰酶吸出棄去(因第1次消化下來的有很多雜細胞)， 再次加入胰酶， 消化10 min后將胰酶吸出轉移至50 ml離心管內， 同時向離心管中加入1.5倍體積的含有20%NCS的DMEM/F12 培養基終止消化。再向培養瓶中加入胰酶，重復操作3次，直到心臟組織變小變白。用50 ml離心管離心，棄去上清后重懸，將懸浮液使用40 μmol/L過濾網過濾后分裝至已經采用0.1%明膠包被的培養皿中，差時貼壁1.5 h后移去培養皿中上清，重新加入新鮮培養基后繼續培養，24 h后再次換液。細胞培養在37℃恒溫、體積分數為5%的CO2培養箱中，采用含有20%NCS和1% 雙抗(青霉素+鏈霉素)的DMEM/F12培養基培養細胞。使用對數生長期的細胞，當細胞密度達到約80%后，使用0.125%的胰酶消化并以1∶2的比例傳代，每次傳代時細胞密度控制在1×105/ml。

1.3 細胞活性檢測 實驗分組：空白對照組，HES 25 μmol/L組，HES 50 μmol/L組，HES 75 μmol/L組，HES 100 μmol/L組。將細胞接種至6孔板中，采用不同的處理因素處理成纖維細胞24 h后，使用0.125%的胰酶消化細胞并小心吹打，使其成為單細胞懸液，分別吸取10 μl細胞與10 μl臺盼藍置于60 μl離心管混合后，再次吸取10 μl混合液放置在細胞計數儀檢測板上對其進行檢測，計數儀自動讀取數據。將空白對照組設為參考值100%，其余組數值與之對比即得出相對細胞活性。本實驗重復3次，取平均值。

1.4 ROS的檢測 實驗分組:空白對照組，單加TGF-β1組(10 ng/ml)，TGF-β1(10 ng/ml)+ HES(25 μmol/L)組，TGF-β1(10 ng/ml)+HES(50 μmol/L)，TGF-β1(10 ng/ml)+HES(100 μmol/L)組。將細胞均勻接種至96孔板中，每孔100 μl，置于溫箱繼續培養24 h，細胞密度達到80%后將培養基更換為無血清的培養基饑餓24 h，然后采用不同處理因素干預24 h，將96孔板中的培養基換為含有10 μmol/L的DCFH/DA 的培養基繼續孵育20 min，之后將培養基吸出，用PBS清洗3次，以排除未進入細胞內部的DCFH/DA的干擾。最后再次加入PBS 100 μl，置于酶標儀下檢測，激發光波長為485 nm，發射光波長為525 nm。ROS 水平(%) =干預組熒光值/空白對照組熒光值×100%，將空白對照組設為參考值100%，其余組ROS水平與之對比即得出相對ROS水平。本實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞增殖能力測定 實驗分組:空白對照組，單加TGF-β1組(10 ng/ml)，TGF-β1(10 ng/ml)+ HES(100 μmol/L)組，TGF-β1(10 ng/ml)+ NAC(1 mmol/L)。將細胞均勻接種至96孔板中，每孔100 μl，置于溫箱培養24 h后將培養基更換為無血清的培養基饑餓24 h，采用不同處理因素干預 24 h后，將培養基換為含有10 μl CCK-8的無血清培養基100 μl，繼續在溫箱中孵育2.0～2.5 h后置于酶標儀下檢測(波長450 nm)。轉化率=干預組細胞的增殖平均值/空白對照組細胞的增殖平均值將。將空白對照組設為參考值100%，其余組數值與之相對比即得出增殖相對比率。本實驗重復3次，取平均值。

2 結 果

2.1HES對細胞活性的影響 臺盼藍染色結果提示，4組不同濃度梯度的HES干預成纖維細胞24h后細胞活性分別為HES25μmol/L組:95%，HES50μmol/L組：94%，HES75μmol/L組: 93%，HES100μmol/L組:93%，與未加任何處理因素的空白對照組(100%)相比，差異無統計學意義。見圖1。

圖1 HES對成纖維細胞活性的影響

2.2HES對ROS產生的抑制作用 與空白對照組相比，TGF-β1刺激成纖維細胞24h后可顯著增加細胞中ROS的產生(P<0.01)；當TGF-β1與HES同時處理時，可呈濃度依賴性地抑制ROS的產生(P<0.05)。見圖2。

圖2 HES可抑制ROS的產生

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與TGF-β1組比較，bP<0.05

2.3HES對TGF-β1誘導細胞增殖的抑制作用 與空白對照組相比，TGF-β1可顯著刺激成纖維細胞的增殖(P<0.01)；而TGF-β1與HES(100μmol/L)同時使用時，與TGF-β1組相比，則可顯著抑制細胞增殖(P=0.017)；TGF-β1與NAC(1μmol/L)同時使用時，同樣可以抑制細胞增殖(P<0.01)。見圖3。

3 討 論

本研究發現，TGF-β1可誘導心肌成纖維細胞的氧化應激損傷，增加胞內ROS的水平。而不同濃度的HES與TGF-β1同時作用于成纖維細胞后，胞內ROS含量明顯低于TGF-β1組(P<0.05)，且呈現濃度依賴性，即隨著HES藥物濃度的增加，對ROS的抑制作用逐漸增強。本研究還發現TGF-β1能夠刺激成纖維細胞的增殖，而HES與TGF-β1同時作用時可顯著逆轉這種現象；NAC作為一種ROS活性抑制劑，同樣能夠抑制TGF-β1誘導的成纖維細胞增殖[4]。因此，推斷HES通過抑制心肌組織成纖維細胞的氧化應激來抑制細胞增殖。

圖3 HES對TGF-β1誘導成纖維細胞增殖的抑制作用

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與TGF-β1組比較，bP<0.05

心肌纖維化是一種常見的心血管系統并發癥，常發生于各種心肌病中[9]。纖維化的持續發展會弱化左室收縮及舒張功能，進而引起射血分數降低，左心功能不全，甚至會導致終末期心功能衰竭[10，11]。而成纖維細胞的增殖與心肌纖維化的發展密切相關，因此控制其增殖對于有效地提高心功能至關重要。

HES作為蕓香科柑橘屬植物的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗癌及抗微生物等多種生理作用[7，8]。在心血管系統中，HES還具有降脂、抗血小板聚集、舒張血管等功效，從而維持心血管系統的正常生理功能[7，12]。

研究表明[13]，氧化/抗氧化失衡是引起機體內氧化應激損傷的重要原因。大量產生的ROS如過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(·O2-)、羥自由基(·OH)等都可與體內大分子物質如核酸及蛋白質分子反應，破壞細胞或組織的正常結構及功能從而引起損傷[13，14]。既往大量實驗證實[1,3,15]，TGF-β1可通過促炎、促氧化應激等途徑引起多個組織器官中ROS的活化及成纖維細胞的增殖，如肺臟、腎小管上皮、心肌組織等。這些學者均認為，ROS是直接促進成纖維細胞增殖的重要因子，并且ROS可通過多種途徑來刺激成纖維細胞的增殖并分泌膠原分子進一步促進組織器官的纖維化。因此控制成纖維細胞中ROS的水平對于其增殖能力十分關鍵。許多研究者認為，ROS在機體內是一把雙刃劍，在正常生理條件下，機體內ROS的產生和降解處于一種動態平衡，一旦受到促炎因子刺激，ROS的清除能力減弱，進一步引起內皮細胞的炎性損傷及功能障礙。少量的ROS作為胞內的重要信使分子起到了一定的積極作用，但過量的ROS可介導炎性反應或氧化應激，引起血管內皮的損傷從而引起心血管系統疾病。Liu等[4]認為，TGF-β1可刺激機體多個組織器官產生ROS，而ROS能夠進一步反饋性活化TGF-β1，從而進一步刺激成纖維細胞的增殖和細胞外基質的沉積。該研究表明[4]，在成纖維細胞中，TGF-β1不僅可通過活化胞中的NOX4分子并刺激線粒體及微粒體中H2O2的表達，還可激活下游的Smad2或Smad3分子進而促進心肌組織發生上皮向間質轉化(EMT)，使成纖維細胞大量增殖并遷移；另一方面，TGF-β1增加心肌組織中產生大量的ROS，并降低谷胱甘肽、過氧化物酶、谷氧化蛋白等抗氧化物的水平，降低心肌組織抗氧化損傷的能力；此外，大量的ROS可激活MAPK信號通路，使pERK、p38、pJNK等大量表達，引起各種促肥厚及促纖維化分子表達增加，有利于成纖維細胞的增殖而進一步引起心肌纖維化。

本結果表明，TGF-β1可提高心肌組織內成纖維細胞中ROS的水平并誘導細胞增殖，當HES與TGF-β1同時作用時可逆轉以上現象。說明HES可抑制TGF-β1誘導的心肌成纖維細胞氧化應激，從而抑制細胞增殖。證實了HES可通過直接抑制心肌成纖維細胞中ROS的產生從而發揮抗心肌成纖維細胞增殖的作用，從而可有效地抑制心肌纖維化的發生發展，這為HES將來的臨床應用提供了一定的基礎實驗依據。但本次實驗局限于細胞水平，未研究動物在體實驗，心肌纖維化的其他標記物也尚未檢測，因此存在一定的局限性，HES具體的分子機制仍需要進一步闡明。

1 張召才.心肌纖維化的研究進展[J].臨床心血管病雜志,2004,20(1):58-60.

2 馬金,丁春華.心臟成纖維細胞與心肌纖維化[J].中華心血管病雜志,2014,42(3):269-272.

3 劉蘋,李平,彭艷,等.原代成纖維細胞和纖維肉瘤細胞自分泌轉化生長因子β1濃度檢測及對轉化生長因子β1增殖的調節[J].中國組織工程研究與臨床康復,2011,15(41):7669-7672.

4LiuRM,PraviaK.OxidativestressandglutathioneinTGF-beta-mediatedfibrogenesis[J].FreeRadicalBiologyandMedicine,2010,48(1):1-15.

5ChanEC,PeshavariyaHM,LiuGS,etal.Nox4modulatescollagenproductionstimulatedbytransforminggrowthfactorbeta1invivoandinvitro[J].BiochemBiophysResCommun,2013,430(3):918-925.

6YuM,ZhengY,SunHX,etal.InhibitoryeffectsofenalaprilatonratcardiacfibroblastproliferationviaROS/P38MAPK/TGF-beta(1)signalingpathway[J].Molecules,2012,17(3):2738-2751.

7WuL,OngS,TalorMV,etal.CardiacfibroblastsmediateIL-17A-driveninflammatorydilatedcardiomyopathy[J].JExpMed,2014,211(7):1449-1464.

8SoudersCA,BowersSL,BaudinoTA.Cardiacfibroblast:theRenaissancecell[J].CircRes,2009,105(12):1164-1176.

9LindnerD,ZietschC,TankJ,etal.Cardiacfibroblastssupportcardiacinflammationinheartfailure[J].BasicResCardiol,2014,109(5):428.

10 許冬梅,劉靂,程翼宇,等.氧化應激與DNA損傷[J].動物營養學報,2013,25(10):2238-2245.

11 丁嵩濤,劉洪濤,李文明,等.梔子苷對氧化應激損傷血管內皮細胞的保護作用[J].中國藥理學通報,2009,25(6):725-729.

12RhyuDY,ParkJ,SharmaBR,etal.Roleofreactiveoxygenspeciesintransforminggrowthfactor-betal-inducedextracellularmatrixaccumulationinrenaltubularepithelialcells[J].TransplantProc,2012,44(3):625-628.

13 鐘長軍.氧化應激在特發性肺纖維化中的作用及其機制研究進展[J].安徽醫學,2012,33(2):245-247.

14 楊蓉,常亮,劉金明，等.羅格列酮對高糖刺激下新生大鼠心臟成纖維細胞Ⅰ型前膠原表達的調節[J].中國醫藥導報,2013,10(21):9-12.

15 朱小琴,華曉芳,李磊，等.橙皮素抗apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化作用及其機制[J].疑難病雜志,2015,14(2):171-174.

Effect of hesperetin on cardiac fibroblast proliferarion induced by TGF-β1

HUZhefu,TANGQizhu,LIUYuan,LIJin,ZHANGWenbin.

DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,HubeiProvince,Wuhan430060,China

TANGQizhu,E-mail:qztang@whu.edu.cn

Objective To investigate the effect of hesperetin (HES) on transforming growth factor-β1(TGF-β1) cardiac fibroblasts induced cell proliferation, and to explore its possible mechanism.Methods 30 SD rats were included; take the myocardial tissues to culture the fibroblasts. And then uses the TGF-β1(10 ng/ml) to stimulate fibroblast cells, with 4 different concentrations of HES (25 μmol/L, 50 μmol/L, 75 μmol/L, 100 μmol/L) to intervene fibroblasts for 24 h, blue staining was used to detect the effect on cell viability by trypan; enzyme-linked fluorescent immunoassay testing method was used for the detection of intracellular reactive oxygen species (ROS) level; living cell counting Kit (CCK-8) was used to detect the proliferation of fibroblasts. Results Trypan blue staining results indicated that, HES had no significant effect on fibroblast activity in cells, each activity values were blank control group:100%，HES 25 μmol/L group: 95%，HES 50 μmol/L group: 94%，HES 75 μmol/L group: 93%，HES 100 μmol/L group: 93%，enzyme mark instrument results show that, compared with the blank control group, TGF-β1can increase the level of ROS in fibroblast cells (P<0.01),whenHESandTGF-β1haveeffectatthesametime,ROSlevelsdecreasedgraduallywiththeincreaseofHESconcentration,therewerestatisticalsignificance(P<0.05);TGF-β1couldstimulatetheproliferationoffibroblasts(P<0.01),whenHES(100μmol/L)orN-acetylcysteine(NAC) (1mmol/L)andTGF-β1haveeffectatthesametime,theycaninhibitfibroblastproliferation(P<0.01).Conclusion Through inhibiting TGF-β1induced oxidative stress, HES can inhibit the proliferation of cardiac fibroblasts, which suggested that it may have potential for the prevention of myocardial fibrosis.

Hesperetin; Transforming growth factor β1;Fibroblasts; Cell activity

中央高校基本科研業務費專項基金資助項目(No.2012302020212)

430060 武漢大學人民醫院心血管內科

唐其柱，E-mail:qztang@whu.edu.cn

2015-01-04)