水皰性口炎病毒熒光R T-PC R 鑒別檢測方法的建立與應用

臧京帥，高志強，王麗萍，郭金玉，傅 毅，牛建蕊，劉文曉，張樂萃，張鶴曉

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島266109 ；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽100026；3.北京森康生物技術開發有限公司，北京 懷柔101400）

水皰性口炎（Vesicular stomatitis，VS）是由水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）引起的動物病毒性傳染病，VSV 可感染馬及其他多種動物，其中馬的易感性最強。其臨床特征為短期發熱，口腔黏膜、乳頭上皮、蹄冠部出現丘疹和水皰。VSV 有2 個血清型，即印第安納型（VSVIND）和新澤西型（VSV-NJ）。VS-NJ 主要發生在美洲，法國和南非曾有該病的報道[1]，VSV-IND 在巴西和阿根廷呈周期性發生。水皰性口炎是目前我國重點防范的外來疫病之一。隨著我國與國外的動物及動物產品貿易增長，VS 傳播的風險不可忽視，建立可靠的檢測技術對嚴防該病的傳播意義重大。

水皰性口炎常規診斷方法主要包括病毒分離和血清學方法。病毒分離需進行細胞接毒培養，不僅耗時費力，且野毒常常難于在體外培養細胞中增殖[2]。由于國內缺乏水皰性口炎病毒標準血清等診斷試劑，血清學方法的建立和應用，由于國內水泡性口炎病毒標準血清等診斷試劑的缺乏而受到限制，同時，血清學方法檢測抗體不利于感染早期快速診斷。常規RT-PCR 方法檢測VSV 并鑒別血清型的研究已有報道[2-3]，但基于凝膠電泳的RT-PCR，需要在擴增結束后進行凝膠電泳分析，易污染。

序列分析表明，VSV 兩個血清型的L 基因存在差異，可以用來鑒別分型。本研究針對L 基因設計1對通用引物，理論上可以擴增所有VSV-NJ 和VSVIND 病毒核酸，然后針對VSV-NJ 和VSV-IND 分別設計TaqMan 探針，用于兩個血清型病毒核酸的分型鑒別。方法建立后，應用兩個血清型的病毒核酸以及其他一些馬病病原核酸對方法進行驗證，結果顯示，建立的方法特異性良好，對兩個型病毒核酸的分型檢測中未見交叉反應，初步表明，建立的方法可用于VSV 的快速分型檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞 VSV-IND 核酸，中國農業大學動物醫學院提供；VSV-NJ，美國NVSL 提供；東部馬腦脊髓炎病毒ssp. North American variant 株核酸，西部馬腦脊髓炎病毒McMillan 株核酸，由軍事醫學科學院提供；馬動脈炎病毒CVL Bucyrus 核酸，由美國NVSL 提供。馬皰疹病毒1 型核酸，馬流感病毒H3N8 核酸，口蹄疫病毒核酸，VERO 細胞均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器設備 TRIZol，購自Invitrogen公司；M-MLV 反轉錄酶、Taq DNA 聚合酶、RNA 酶抑制劑、dNTP、DL-2 000 Marker 等，購自Promega 公司。

主要儀器有熒光定量PCR 儀（Roche LightCyclerⅡ），臺式冷凍高速離心機（Eppendorf Centrifuge 5417R）。

1.3 病毒半數感染量（TCID50）的滴定 將兩血清型病毒參照邵振華等[5]的方法，計算TCID50，按Reed Muench 方法計算TCID50/50 μL。

1.4 引物探針設計 對GenBank 中登錄的兩個型的VSV 病毒株序列進行多重比對后，選擇L 基因進行引物探針設計，利用Oligo6.71 設計1 對通用引物和分別針對兩型病毒的MGB 探針，引物探針序列見表1。

1.5 標準質控品制備與初步定值 使用通用引物VSV1和VSV2擴增水皰性口炎病毒印第安納型（VSVIND）和新澤西（VSV-NJ）的基因片段（與熒光定量RT-PCR 擴增區域相同），引物序列見表1，將擴增片段純化回收后分別克隆于pMD20-T 載體中，命名為VSV-IND-L 和VSV-NJ-L，轉化Top10 大腸桿菌感受態細胞并進行藍白斑篩選。挑取白色菌落經菌落PCR 鑒定為陽性單菌落后，用3～5 mL 液體LB 培養基分別培養，用試劑盒提取質粒。質粒線性化后，用RiboM-AXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6 試劑盒進行體外轉錄。轉錄產物經無RNase 的Dnase 消化除去其中的DNA 模板后，75 ℃10 min 將DNase 滅活，再次抽提純化制備出所需cRNA，分別按照20 μL/管分裝，保存于-80 ℃備用。

表1 VS V 熒光R T-PC R 檢測分型引物探針序列

取制備的cRNA 作1∶100 稀釋，測定其260 nm和280 nm 的吸光度值（A260 和A280）并計算拷貝數，用75% TRIZol 水溶液（TRIZol:水=3∶1）稀釋至1.0×108拷貝數/mL。然后進行分裝，1.0 mL/管。

1.6 熒光RT-PCR 反應條件的優化

1.6.1 引物和探針濃度的優化 將引物濃度以0.1 μM 為間距從0.1 μM 至0.8 μM 遞增，探針濃度以0.025 μM 為間距從0.025 μM 至0.2 μM 遞增。將不同濃度配比的引物和探針進行比較。

1.6.2 Mg2+濃度的優化 應用篩選好的引物探針，將Mg2+的濃度以0.5 mM 為間距從1.5 mM 至6.0 mM 遞增。并將調整后不同濃度Mg2+擴增結果進行比較。

1.6.3 其他條件的優化 引物探針及Mg2+的濃度篩選好后，對Taq DNA 聚合酶用量，反應參數和循環數等條件做進一步的優化。

1.7 靈敏度試驗 將已知TCID50的兩血清型病毒分別進行10 倍梯度稀釋，提取RNA 用建立的方法進行熒光RT-PCR 測定；將已知拷貝數的兩血清型RNA 作系列稀釋，用建立的檢測方法進行熒光RT-PCR 測定，分別確定其檢測極限。

1.8 特異性試驗 用所建立的方法對VSV-NJ，VSV-IND，東部馬腦脊髓炎病毒核酸，西部馬腦脊髓炎病毒核酸，馬動脈炎病毒核酸，馬流感病毒H3N8 核酸，馬皰疹病毒1 型核酸，口蹄疫病毒核酸進行檢測，以及30 份已知陰性樣品的呼吸道拭子進行檢測，以驗證該方法的特異性。

1.9 重復性試驗 對3 份不同TCID50的病毒核酸用所建立的檢測方法分別檢測3 次，根據其各自的CT 值求出變異系數，以驗證該方法的重復性及穩定性。

1.10 臨床送檢樣品的檢測 用上述建立的方法和文獻報道的普通RT-PCR 方法對所采集的257份馬血樣品和85 份牛OP 液樣品進行檢測，驗證方法的臨床實用性。

2 結果

2.1 TCID50測定結果 參考邵振華等[4]的方法，測得VSV-IND 的TCID50為10-6.2/50 μL，VSV-NJ 的TCID50為10-3.65/50 μL。

2.2 反應條件的優化結果 經多次試驗優化最終建立如下體系，見表2。

2.3 熒光定量RT-PCR 反應參數的優化 經多次重復性試驗，我們發現該檢測方法的最適循環參數為42 ℃30 min，92 ℃3 min，92 ℃15 s，55 ℃25 s，65 ℃30 s，42 ℃2 min，40 個循環，60 ℃時收集熒光。

表2 VS V-IND 和VS V-NJ 檢測分型反應體系優化結果

2.4 靈敏度試驗 將已知TCID50的兩血清型的病毒分別進行10 倍系列稀釋，提取RNA，用建立的方法進行檢測，IND 型水皰性口炎熒光定量RT-PCR 檢測方法結果顯示，檢測極限可達0.158 TCID50。NJ 型水皰性口炎熒光定量RT-PCR 檢測方法結果顯示，檢測極限可達0.0045 TCID50。

圖1 為IND 型水皰性口炎病毒RNA（TCID50=10-6.2/50 μL）的熒光RT-PCR 結果。圖2 為NJ 型水皰性口炎病毒RNA（TCID50=10-3.65/50 μL）的熒光RT-PCR 結果。

圖1 IND 型水皰性口炎病毒R NA 的熒光R T-PC R 結果

圖2 NJ 型水皰性口炎病毒R NA 的熒光R T-PC R 結果

采用建立的方法分別對106～101拷貝數VSVIND cRNA 和VSV-NJ cRNA進行熒光RT-PCR 檢測，確定靈敏度。結果顯示，本方法的分析靈敏度對于VSV-IND 以及VSV-NJ 均可達10 拷貝/反應。見圖3。

圖3 VS V-IND 和VS V-NJ cR NA 熒光R T-PC R 檢測極限測定

2.5 特異性試驗 利用本試驗所建立的熒光定量RT-PCR 檢測方法對1.1 所列的病毒核酸進行檢測，結果顯示，建立的方法能很好鑒別VSVIND 和VSV-NJ，但不能檢出其他病原和已知陰性的樣品。表明所建立的檢測方法特異性好。

2.6 重復性試驗 對不同濃度TCID50兩血清型的病毒核酸用所建立的檢測方法重復檢測3 次的結果如表3，對通用檢測方法不同試驗獲得的Ct 值標準差分別位于0.34～0.54（IND）、0.19～0.29（NJ），變異系數分別為2.4%～2.8%（IND）、0.9%～1.4%（NJ）；證實所建立的方法具有良好的重復性和穩定性，可以滿足檢測的需要。見表3。

表3 重復性試驗結果

2.7 臨床樣品檢測結果 用所建立的方法對257份進出口馬血樣品和85 份牛OP 液進行了檢測，結果顯示均為VSV 陰性，并與文獻報道的RTPCR 方法進行了比較，二者符合率100%。結果見表4。

表4 臨床樣品檢測結果

3 結論與討論

熒光定量RT-PCR 是近幾年一種新型的核酸定性、定量技術，極大地簡化了定量檢測過程，而且真正地實現了絕對定量。其自動化操作提高了工作效率，反應快速、靈敏度高、特異性強、重復性好、結果清晰，是目前病毒、細菌檢測技術發展的一個新領域。本研究在鑒別水皰性口炎病毒印第安納型和新澤西型時，針對L 基因（編碼病毒聚合酶）設計一對通用引物，可同時擴增這2 個型的病毒核酸，然后使用TaqMan 探針鑒別這2 個型的毒株。本研究對兩個血清型檢測所用探針標記的熒光發光基團相同，采用兩步法進行鑒別檢測，下一步將對兩種血清型的探針分別標記不同熒光發光基團，這樣可以一步鑒別兩種血清型病毒，達到快速、簡便、經濟的目的，這也是本研究設計通用引物的原因所在。運用建立的方法，所需的檢測時間包括處理樣品、PCR 擴增反應、標準曲線的分析可在3 h 左右完成，試驗結果表明，本方法的靈敏度可達10 拷貝/反應，與已報道的熒光探針RT-PCR 檢測方法相當。

通用引物是利用不同核酸序列之間存在的高度保守區來設計的。本試驗針對VSV 兩血清型L基因的保守區域設計的通用引物與普通的引物相比可以簡便、快捷的同時擴增出VSV 兩血清型的目的片段。

由TCID50測定結果和熒光RT-PCR 標準曲線對比可得，VSV-NJ 型毒株TCID50值較低，但熒光RT-PCR 檢測病毒含量并不低，分析可能是NJ 型毒株與IND 型毒株相比對VERO 細胞致病力較低，雖然病毒增殖明顯，但病理反應不明顯。

此外，通過特異性、敏感性、重復性試驗證明了該方法有較好的特異性、敏感性和重復性，利用建立的熒光定量RT-PCR 方法檢測臨床樣品342 份，結果均為陰性。與已知其他方法檢測結果一致，表明本方法檢測結果可信程度高，為VSV 的分型鑒別檢測以及防治奠定了重要的基礎。

[1] Office International des Epizooties（OIE）.Vesicular Stomatitis[A].Manual of diagnostic tests and vacciners for terrestrial animals，Chapter 2.1.2[EB].http://www.oie.int.

[2] Hofner M C，Carpenter W C，Ferris N P，et al.A hemi-nested PCR Assay for the detection and identification of vesicular stomatitis virus nucleic acid [J].J Viro Method，1994，50：11-20.

[3] Rodriquez L L，Letchworth G J，Spriropoulou C F，et al.Rapid detection of vesicular stomatitis virus New Jersery serotype in clinical samples by using polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol，1993，31：2016-2 012.

[4] 邵振華，田海燕.豬瘟免疫熒光細胞中和試驗的研究[J]. 中國獸醫科技，1988，18（10）：13-16.