缺血性腦卒中患者血清中同型半胱氨酸化蛋白質抗體及危險因素分析

王瑋瑤 ，孫文萍，于洪泉，鄭中華，趙東海，楊淑艷，齊 玲

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是除了高血壓、糖尿病、心臟疾病、吸煙、飲酒等傳統病因外的又一個引起缺血性腦卒中的危險因素［1］。Hcy 增高引起的血管內皮細胞受損等病理變化可導致動脈粥樣硬化性腦梗死的發生和復發［2～5］。實際上體內70%～90%的Hcy 是以同型半胱氨酸化蛋白質的形式存在，這種形式的Hcy 遠大于游離Hcy 和同型半胱氨酸硫內酯的含量，而被修飾后的蛋白質又會被機體識別成異體蛋白，引起一系列的免疫反應。因此，我們推測同型半胱氨酸化蛋白質抗體可能會與Hcy 一樣成為缺血性腦卒中致病的重要組成部分。這方面研究國內還未見相關報道。本實驗檢測患者血清中Hcy 及同型半胱氨酸化蛋白質抗體等指標的水平，為缺血性腦卒中的防治提供更多的依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 L-同型半胱氨酸硫代內酯購自美國Sigma 公司，辣根酶標記抗人IgG 抗體購自美國Sigma 公司。二氨基聯苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑購自美國Epitomics 公司。J-26XP 超低溫高速離心機(美國貝克曼公司);超低溫冰箱(MDF-U53V，三洋);PLUS 384 全自動酶標儀(MDC 公司)。

1.2 研究對象 收集2012 年7 月～2012 年12 月入住北華大學附屬醫院神經三療區患者的全血標本。樣本總數共為111 例，其中男性患者65例，女性患者46 例;年齡34～82 歲，平均年齡62歲;其中75 人臨床診斷為缺血性腦卒中患者，36 人為正常體檢患者(作為正常對照組)。本研究通過北華大學附屬醫院倫理委員會的審核，所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 正常組和缺血性腦卒中組患者血清的獲得 收集缺血性腦卒組及正常對照組人員的全血標本，將試管置于試管架上靜置4 h 左右，置入高速離心機中，以3000 r/min 離心15 min，取上清分裝放入1.5 ml 離心管中，標記后將所有標本放入4 ℃冰箱中，保存備用。

1.3.2 抗原制備 將0.2 mmol/L 同型半胱氨酸硫代內酯與10 mg/ml 人血白蛋白在pH 7.4，37 ℃的條件下配成作為抗原，4 ℃備用［6］。

1.3.3 ELISA 法檢測患者血清中同型半胱氨酸化蛋白質抗體的表達 在96 孔酶標板中加入100 μl 抗原，與包被液共同孵育，4 ℃冰箱過夜;次日棄上清，每孔加入200 μl 1%BSA，37 ℃培養1 h(每個樣本5 個復孔，同時設置陽性對照孔和空白對照孔)，PBST 洗滌后每孔加入100 μl 人血清置于4 ℃冰箱內過夜，用PBST 再次洗滌后加入100 μl(稀釋1∶ 10000)辣根過氧化物酶標記的抗人IgG，37 ℃孵育1 h;顯色，濃硫酸終止反應;于自動酶標儀492 nm 處測定(A)值，用標準品繪制標準曲線后計算樣本濃度。

2 結果

2.1 血清同型半胱氨酸與同型半胱氨酸化蛋白質抗體水平 分析患者臨床Hcy 檢驗提供數據顯示:腦卒中組患者血清中Hcy 水平明顯升高，與正常對照組比較，差異具有統計學意義(P ＜0.01)。ELISA 結果顯示:腦卒中組患者血清中同型半胱氨酸化蛋白質抗體水平明顯升高，與正常對照組比較，差異亦具有統計學差異(P ＜0.01)，見表1 所示。

2.2 血清生化指標、葉酸和維生素B12水平血清生化指標檢測結果顯示:腦卒中組患者甘油三酯、低密度脂蛋白和血糖呈升高趨勢，尤其是腦卒中組血糖值明顯升高，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P ＜0.05)。而總膽固醇、高密度脂蛋白呈下降趨勢，與正常對照組比較，差異沒有統計學意義(P ＞0.05)。腦卒中組患者的葉酸水平呈下降趨勢，與正常對照組比較，差異無統計學意義(P ＞0.05);腦卒中組的維生素B12升高，與正常對照組比較，差異亦沒有統計學差異(P ＞0.05)。結果如表2 所示。

表1 血清中同型半胱氨酸與同型半胱氨酸化蛋白質抗體水平

表2 血清中生化指標水平

3 討論

腦卒中是臨床上的常見病和多發病。近年來，腦卒中的發病人群越來越年輕化。缺血性腦卒中約占全部腦卒中的70%，已嚴重影響了人們的生活質量。很多腦卒中患者并無傳統的危險因素，但是在各種缺血性疾病的發生發展過程中同型半胱氨酸發揮了重要的作用，它是動脈硬化性血管病發生的又一新的獨立危險因素［7，8］。因此，本實驗分析了缺血性腦卒中患者血清Hcy 水平，結果發現:缺血性腦卒中組患者的Hcy 水平明顯地高于對照組，這與Hcy 已被公認為腦卒中危險因素之一的結論是相符的。

Hcy 在體內可以修飾蛋白質，修飾方式主要有N-同型半胱氨酸化(以同型半胱氨酸硫代內酯為代表)和S-同型半胱氨酸化(以同型半胱氨酸為代表)兩類。同型半胱氨酸化的蛋白質在體內會被識別為自身抗原，進而引起自身免疫反應，形成同型半胱氨酸化蛋白質抗體，并在血管內皮表面形成復合物，再進一步損傷血管。當上述這一反應持續的、緩慢的發生，就會反復出現損傷-修復過程，最終損傷血管管壁，造成動脈粥樣硬化引起腦卒中。在國外有用ELISA 法檢測長期血液透析腎衰竭患者血中的同型半胱氨酸化蛋白質抗體的水平［9］，但尚無腦卒中患者同型半胱氨酸化蛋白質抗體水平的研究。因此，本實驗應用ELISA 法檢測缺血性腦卒中患者血清中同型半胱氨酸化蛋白質抗體水平，發現患者同型半胱氨酸水平明顯高于對照組。這說明缺血性腦卒中患者體內高Hcy 水平導致了過多的同型半胱氨酸化蛋白質抗體產生，這與腦卒中的發病可能有密切的關系。

除了Hcy 以外，血脂、血糖水平等都是引起腦卒中的傳統危險因素。本實驗也研究了這些傳統因素對腦卒中的相關性。發現腦卒中組患者甘油三酯、低密度脂蛋白、血糖呈升高趨勢，血糖值則明顯升高。而高密度脂蛋白則呈下降趨勢，本實驗結果與傳統觀點保持了一致性。本實驗也研究了腦卒中組患者血清中葉酸、維生素B12的水平，發現患者血中的葉酸水平呈下降趨勢，而維生素B12則升高。血液中蛋氨酸甲基化的過程需要葉酸和維生素B12作為輔基，因此，如果腦卒中的患者血中葉酸和維生素B12水平較低，患者血液的Hcy 就會有所升高，這與之前的研究結果相一致［9］。由此，我們可以認為葉酸的攝入增加可降低腦血管疾病的發生風險。但本實驗中維生素B12結果與以往研究不同，還需要在以后更多病例的收集過程中，進行更深入的研究。

由于Hcy 已被公認為是腦卒中的獨立危險因素，控制血清中Hcy 水平已成為預防和治療腦卒中疾病的新環節。本實驗通過分析證明了血中同型半胱氨酸化蛋白質抗體、Hcy 水平與腦卒中發病的聯系以及傳統因素的變化。可為臨床腦卒中治療和研究提供依據。

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