晚發型Pompe 病患者的臨床、病理及GAA 基因突變特點

趙丹華，才麗娜，楊 旭，李繼來，杜繼臣

Pompe 病，又稱糖原累積病Ⅱ型(GSDⅡ)，是一種罕見的常染色體隱性遺傳的溶酶體貯積病，為編碼酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的基因突變導致溶酶體內糖原分解障礙并廣泛沉積于全身所致［1］。根據發病年齡、受累器官及疾病進展情況，可將Pompe病患者分為嬰兒型(infantile-onset Pompe disease，IOPD)及晚發型(late-onset Pompe disease，LOPD)兩種。典型的IOPD 患者生后數月即發病，主要表現為心臟擴大、肌張力低下及呼吸窘迫，2 歲前死亡;而LOPD 患者1 歲后發病，又可分為兒童型、青少年型及成人型，主要表現為中軸肌及四肢骨骼肌無力，部分伴隨骨骼及心腦血管病變［1～3］。目前臨床上對LOPD 的認識不足，導致許多患者從就診到確診的時間長于5 y［4］。在此，我們對1 例LOPD 患者的臨床表現、病理改變及分子遺傳學基礎進行了詳細的研究。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 23 歲女性，主因“腹脹1 w，加重伴憋氣3 d”就診。患者于入院前1 w 無明顯誘因出現腹脹、腹圍增加，4 d 后加重，伴胸悶、憋氣，不能平臥。外院查腹部B 超提示腹水(深度5.1 cm);心電圖示:竇性心律，順鐘向轉位，電軸右偏;超聲心動示:右心增大(右房橫徑44 mm，右室橫徑37 mm)伴三尖瓣關閉不全，肺動脈高壓(52 mm-Hg)，左室射血分數69%，少量心包積液;胸片示:雙下肺紋理增粗、模糊，心影略飽滿。臨床診斷為肺動脈高壓，右心功能不全，給予利尿等治療，癥狀一度好轉，后又加重。為求進一步診治收入我院心內科。入院當日患者神志清楚，無明顯憋氣，自行步入病房。查血氣分析示:pH 7.334，PaO233 mmHg，PaCO284 mmHg，SpO256%，提示Ⅱ型呼吸衰竭。予低流量吸氧、利尿及興奮呼吸等治療無效，患者PaCO2進行性升高，意識水平逐漸下降，復查血氣分析示pH 7.029，PO248 mmHg，PCO2＞130 mmHg，SpO285%。遂立即給予氣管插管，呼吸機輔助呼吸，0.5 h 后神志轉清，復查血氣分析恢復正常。此后患者病情穩定，復查超聲心動示右心室大小及肺動脈壓力均降至正常，腹部B 超未見腹水，且呼吸機參數逐漸下調至可脫機水平，但拔管撤機后患者很快出現明顯的呼吸費力，指尖氧飽和度迅速下降至70%以下，故再次予氣管插管，呼吸機輔助呼吸。此后患者始終維持壓力支持通氣模式(壓力支持8 mmHg，吸入氧濃度30%)，多次嘗試脫機均失敗。

為明確病因，進一步追問病史，發現患者3 y 前出現雙下肢活動后易疲勞癥狀，緩慢加重，但不影響生活及工作;6 m 前家人發現其睡眠中呼吸節律較慢，有張口呼吸及聳肩動作。患者父母非近親結婚，家族史陰性。神經系統查體示四肢近端肌力4 級，遠端5 級，四肢肌容積顯著減少，體質指數(BMI)13.7 kg/m2。肌酶無異常。干血片法檢測患者外周血GAA 酶活性為5.98 pmol/punch/hr(正常參考范圍20～40 pmol/punch/hr)。

1.2 研究方法

1.2.1 骨骼肌病理檢查 經知情同意，對患者行右股四頭肌活體組織檢查。肌肉標本進行常規組織學和酶組織化學染色，染色方法包括:蘇木精-伊紅(HE)、改良Gomori 染色、高碘酸Schiff 反應(PAS)、油紅“O”脂肪染色、三磷酸腺苷酶、還原型輔酶I 四氮唑還原酶(NADH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、細胞色素氧化酶(COX)、非特異性酯酶(NSE)染色。

1.2.2 基因檢查 采集患者4 ml 靜脈血并提取基因組DNA。PCR 反應擴增GAA 基因1～20 號外顯子及其側翼序列，PCR 產物送北京華大中生科技發展有限公司，用ABI3730XL 型DNA 全自動測序儀進行直接測序。所有PCR 產物均進行雙向測序。對發現的新突變在100 例正常對照中進行篩查。

1.2.3 逆轉錄 用TRIzol 試劑一步法提取患者總RNA，在M-MLV 逆轉錄酶作用下反轉錄得到第一鏈cDNA。以cDNA 為模板進行PCR 反應，使用Primer 3 設計引物覆蓋第9、10 號外顯子全長及部分11 號外顯子，(正向引物:5'CGTTCAACAAGGATGGCTTC 3’，反向引物5'GTGGGTTCTCCAGCTCATTG 3’)。應用瓊脂糖凝膠檢測PCR 產物并進行雙向測序。

2 結果

骨骼肌主要病理改變為肌纖維內出現大量嗜堿性空泡，部分空泡內可見PAS 深染物質沉積(見圖1)，未見脂肪滴成分，空泡肌纖維累及兩型，以Ⅱ型肌纖維為主，部分肌纖維內出現NSE 深染物質沉積，上述病理改變提示GSDⅡ可能。

GAA 基因分析顯示，患者第16 號外顯子上存在c.2238G ＞C 突變，為已報道的致病性突變;第10 號內含子存在c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT缺失突變(見圖2)，經逆轉錄PCR 證實該突變可以導致mRNA 上第10 號外顯子丟失，其編碼的38 個氨基酸(p.480-517)被跨越，產生截短蛋白(見圖3)，進一步在100 例正常對照者中均未檢測到該缺失突變。

圖1 患者的骨骼肌病理結果

圖2 患者GAA 基因測序分析

圖3 患者逆轉錄PCR 產物凝膠電泳及測序分析

3 討論

本例患者青年發病，主要表現為嚴重呼吸功能障礙及輕度四肢近端無力，外周血白細胞GAA 酶活性低于正常對照的30%，肌肉活檢顯示空泡性肌病，部分空泡內可見PAS 深染物質沉積，故診斷為LOPD。GAA 基因檢測顯示患者存在c.2238G ＞C及c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 復合雜合突變，進一步從基因水平上確診該病。結合其發病年齡，該患者屬于成年型。

肢帶型肌無力伴呼吸肌力弱是LOPD 患者最常見的臨床表型［3］。本例患者在疾病早期即出現了呼吸衰竭，而肢體運動功能相對保留，提示其呼吸肌受累較四肢骨骼肌更嚴重。有研究表明，部分LOPD 患者以呼吸困難為首發癥狀，發病數年后才喪失行走能力，甚至有個別患者可以通過使用便攜式呼吸機自己步行到醫院復診［4，5］。由此可見，LOPD 患者呼吸功能障礙突出。但是，也有部分患者首先出現肢體無力，坐輪椅10 余年后方才需要使用呼吸機。因此，LOPD 患者在呼吸肌和骨骼肌受累的順序方面存在很大異質性，其呼吸肌功能與四肢肌力之間無相關性［4，6］。

Pompe 患者的呼吸功能障礙主要表現為限制型通氣障礙，以吸氣肌無力突出，尤其是膈肌［7］。膈肌力弱首先表現為臥位肺活量較立位明顯下降，導致夜間低通氣及高碳酸血癥，繼而出現睡眠呼吸障礙、清晨頭痛及白天睡眠過多等不適。本例患者在就診前有入睡后張口呼吸及聳肩等表現，提示當時已存在夜間呼吸困難，但未引起注意。隨著疾病的進展，呼吸肌力逐漸下降，LOPD 患者白天肺活量亦下降，出現低氧血癥、肺心病及呼吸衰竭［8～10］。本患者在就診時亦存在明確的肺動脈高壓、右心功能不全及呼吸衰竭表現，其臨床特點符合該病的發展規律。雖然有文獻報道LOPD 患者存在肺靜脈閉塞病(PVOD)，是導致肺高血壓的原因［11］，但本患者的肺動脈收縮壓在糾正了低氧及高碳酸血癥之后降至正常，故推測缺氧等可逆性因素在其肺高血壓的形成過程中發揮了更大的作用。

脊柱強直綜合征伴低體重是LOPD 患者另一種常見的臨床表型［3］。本例患者僅有BMI 過低，而沒有脊柱強直表現。LOPD 患者出現BMI 過低，推測可能與以下幾種因素有關:疾病本身導致的吞咽困難、胃腸功能障礙、嚴重的肌肉萎縮及呼吸功能障礙。因為長期的呼吸功能不全會導致體內能量的過度消耗，繼而引起BMI 明顯下降，而給予酶替代治療后，隨著肌力的改善，患者BMI 指數亦增加［12］。但也有文獻報道酶替代治療不能改善LOPD 患者的BMI，并認為BMI 過低是其預后不良的指標之一［11］。

GAA 基因全長28kb，包含20 個外顯子，共編碼952 個氨基酸［2］。目前已報道該基因突變300 余種(www.pompecenter.nl)。本例患者存在c.2238G＞C 及c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 復合雜合突變。其中，c.2238G ＞C 點突變為已報道的致病性突變，也是中國內地及中國臺灣LOPD 患者的熱點突變［2，13，14］;而c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 缺失突變為新突變，該突變導致mRNA 上第10 號外顯子缺失，其所編碼的38 個氨基酸被跨越。由于p.470-517 位于該蛋白的催化結構域，其后連接活性中心D518，且N470 也是蛋白翻譯后進行糖基化修飾的7 個位點之一［15］，因此推測10 號外顯子缺失將對蛋白的結構和催化功能產生重要影響;同時，在100 例健康對照者均未發現相同突變，綜合以上分析考慮該突變為致病性突變。而剪切突變導致的關鍵結構域的受損，也許是患者病情較重且迅速進展的原因之一。

［1］van der Ploeg AT，Reuser AJ.Pompe's disease［J］.Lancet，2008，372(9646):1342-1353.

［2］Wan L，Lee CC，Hsu CM，et al.Identification of eight novel mutations of the acid alpha-glucosidase gene causing the infantile or juvenile form of glycogen storage disease type Ⅱ［J］.J Neurol，2008，255(6):831-838.

［3］Schüller A，Wenninger S，Strigl-Pill N，et al.Toward deconstructing the phenotype of late-onset Pompe disease［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2012，160C(1):80-88.

［4］Hagemans ML，Winkel LP，Van Doorn PA，et al.Clinical manifestation and natural course of late-onset Pompe's disease in 54 Dutch patients［J］.Brain，2005，128:671-677.

［5］Van der Beek NA，Haqemans ML，Reuser AJ，et al.Rate of disease progression during long-term follow-up of patients with late-onset Pompe disease［J］.Neuromuscul Disord，2009，19(2):113-117.

［6］Mellies U，Ragette R，Schwake C，et al.Sleep-disordered breathing and respiratory failure in acid maltase deficiency［J］.Neurology，2001，57(7):1290-1295.

［7］金巍娜，闕呈立，唐海燕，等.晚發型糖原貯積病Ⅱ型患者呼吸功能臨床研究［J］.中國現代神經疾病雜志，2014，14(5):399-404.

［8］Mellies U，Lofaso F.Pompe disease:a neuromuscular disease with respiratory muscle involvement［J］.Respir Med，2009，103(4):477-484.

［9］Shahrizaila N，Kinnear WJ，Wills AJ.Respiratory involvement in inherited primary muscle conditions［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2006，77(10):1108-1115.

［10］Mellies U，Stehling F，Dohna-Schwake C，et al.Respiratory failure in Pompe disease:treatment with noninvasive ventilation［J］.Neurology，2005，64(8):1465-1467.

［11］Kobayashi H，Shimada Y，Ikeqami M，et al.Prognostic factors for the late onset Pompe disease with enzyme replacement therapy:from our experience of 4 cases including an autopsy case［J］.Mol Genet Metab，2010，100(1):14-19.

［12］Ravaglia S，Danesino C，Moglia A，et al.Changes in nutritional status and body composition during enzyme replacement therapy in adult-onset type Ⅱglycogenosis［J］.Eur J Neurol，2010，17(7):957-962.

［13］Liu X，Wang Z，Jin W，et al.Clinical and GAA gene mutation analysis in mainland Chinese patients with late-onset Pompe disease:identifying c.2238G ＞C as the most common mutation［J］.BMC Med Genet，2014，15(1):141.

［14］Yang CC，Chien YH，Lee NC，et al.Rapid progressive course of later-onset Pompe disease in Chinese patients［J］.Mol Genet Metab，2011，104(3):284-288.

［15］Kroos M，Hoogeveen-Westerveld M，van der Ploeg A，et al.The genotype-phenotype correlation in Pompe disease［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2012，160(1):59-68.