人羊膜上皮細胞移植治療帕金森病模型大鼠的療效評價

陳 勇，方 寧，陳代雄，趙春華

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見于中老年人群的第二大中樞神經系統退行性疾病。PD 的發生與蛋白質二硫鍵異構酶、Parkin 基因等多種因素有關，其病理表現為大腦黑質多巴胺能神經元的變性、缺失，導致多巴胺神經遞質減少［1，2］。PD的治療手段以藥物治療和手術治療為主，但均只能緩解癥狀，且有發生不良反應和并發癥風險［3］。目前，細胞治療PD 患者或動物模型已取得很大成功，可望成為治療PD 的新手段和趨勢［4～6］。人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)源于胎盤羊膜組織，研究顯示，hAECs 具有明顯的可塑性和多向分化潛能，在不同體外誘導條件下，可分化成來源于3 個胚層的不同組織細胞類型，同時其還具有低免疫原性和免疫調節作用［7～10］。此外，hAECs獲取無侵入性傷害、易于制備、無倫理限制等優勢。本實驗通過動態行為學觀察，評價原位移植hAECs 對PD 模型大鼠的療效及其在腦組織中的存活、分化。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級雌性Wistar 大鼠30 只，體重220～250 g，購自第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心［許可證號:SCXK(渝)2007-0005］。LGDMEM 培養基和FBS(GIBCO，烏拉圭);GlutaMax(GIBCO 公司，美國);小鼠抗人細胞核抗體(MAB1281;Chemcion，美國);兔抗人神經元微管結合蛋白(microtubule associated protein-2，MAP-2)抗體(SANTA CRUZ，美國);阿樸嗎啡(Apomorphine，APO)、6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)和小鼠抗人角蛋白(CK19)抗體(Sigma，美國);流式細胞術檢測抗體CD29-PE，CD34-PE，CD45-FITC，CD44-FITC，CD73-PE，CD71-PE，CD80-FITC 和CD86-PE(BD，美國);兔抗大鼠酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 hAECs 的分離、培養及表型分析 經產婦知情同意采集足月剖宮產羊膜，采用胰蛋白酶消化法分離hAECs，將分離的hAECs 懸浮于含10%FBS、1% GlutaMAX、55 μmol/Lβ-巰基乙醇和1%NEAA 的L-DMEM 培養基中，按5 ×105/cm2接種于培養瓶，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。細胞生長面積達80%以上即進行傳代培養，第3 代細胞用于細胞移植，并采用流式細胞儀(FACS Calibur.BD)檢測其表型。取第3 代hAECs，按組合方案加入熒光素標記的CD29-PE，CD34-PE，CD44-FITC，CD73-PE，CD80-FITC 和CD86-PE 的抗體振蕩混勻，每份樣品的采集細胞數≥104個，Cell Quest 軟件進行表型分析。同型對照抗體為相應的熒光素標記的小鼠IgG。制備第3 代hAECs 爬片，進行免疫組化染色檢測CK19。

1.2.2 模型制備 大鼠用7%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 ml/100 g)，固定于腦立體定位儀上，按Leaver 等［11］方法，參照大鼠腦立體定向圖譜確定右側前腦內側束(medial forebrain bundle，MFB)，坐標:前囟后4.6 mm，矢狀縫左側1.2 mm，顱骨骨膜下8.2 mm。用微量注射器3 μl 6-OHDA(0.1% Vit C 臨用前配制，濃度4 μg/μl)注入MFB，注射速度1 μl/min，留針15 min，退針速度為1 mm/min。建模后1 w，腹腔注射多巴胺受體激動劑APO 0.5 mg/kg 誘導旋轉，每周1 次連續4 w。若每次大鼠均以損毀側下肢為支撐點向健側(左側)旋轉，而且30 min 內平均旋轉次數超過7 轉/min，視為造模成功［12］。假手術組以生理鹽水代替6-OHDA，其余操作同模型組。

1.2.3 實驗分組與細胞移植 PD 模型大鼠隨機分為模型組、hAECs 原位移植組和假手術組，每組10 只。取第3 代hAECs 用不含血清的L-DMEM 培養基懸浮。原位移植組于造模注射位點注射8 μl hAECs 懸液(含3 ×105個細胞)，模型組同步注射等體積L-DMEM 培養基。

1.2.4 行為學觀察 細胞移植后各組PD 大鼠每周定時腹腔注射APO(0.5 mg/kg)誘導PD 樣癥狀，待大鼠旋轉穩定后，攝像記錄5 min 內大鼠旋轉次數(連續觀察10 w)。

1.2.5 hAECs 存活及分化檢測 分別于hAECs 移植后2 w 和12 w 每組取5 只大鼠，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，經心插管依次用生理鹽水和4%多聚甲醛后，取腦組織置于4%多聚甲醛4 ℃固定，梯度蔗糖脫水，原位移植區連續冰凍切片，片厚20 μm。切片經通透、封閉，滴加MAB1281 和MAP-2 抗體混合液4 ℃孵育過夜，用PBS 替代一抗作為對照。滴加 PE 標記的羊抗小鼠 IgG (針對MAB1281)與FITC 標記的羊抗兔IgG(針對MAP-2)混合液，DAPI 復染，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 酪氨酸羥化酶免疫組化染色 冰凍切片3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS 漂洗，滴加TH 抗體(1∶ 300 稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS 漂洗，DAB 顯色，沖洗，光學顯微鏡下觀察。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，數據以()表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hAECs 形態及表型特征 hAECs 呈典型的貼壁生長特性，形態呈鋪路石樣，鵝卵石狀(見圖1A)。第3 代hAECs 表達CK19(見圖1B)。流式細胞術分析結果顯示，第3 代hAECs 不表達CD 34、CD 80 和CD 86，高表達CD 73、CD 44 和CD 29(見圖2)。

圖1 hAECs 形態

圖2 hAECs 流式細胞術表型分析

2.2 hAECs 移植后PD 大鼠行為學變化 假手術組無1 例出現旋轉行為。hAECs 原位移植組大鼠于移植后2 w 開始旋轉次數均明顯減少(均P ＜0.05);至10 w，原位移植組大鼠旋轉次數仍明顯低于模型組(均P ＜0.05)(見圖3)。

圖3 hAECs 移植后PD 大鼠行為學變化

2.3 hAECs 在腦內存活與分化 hAECs 移植后2 w 和12 w，原位移植組原位移植區腦組織均可見人細胞核特異性抗原陽性細胞(呈紅色熒光)，其中部分陽性細胞表達MAP-2(呈綠色熒光)(見圖4)。

圖4 hAECs 原位移植后表達MAP-2(免疫熒光染色，×400)

2.4 酪氨酸羥化酶的表達 hAECs 移植后2 w，原位移植組大鼠黑質紋狀體TH 表達較對照組(control)明顯上調，假手術組(sham lesioned)TH 表達最高(見圖5)。

圖5 移植后2 w 各組大鼠黑質酪氨酸羥化酶的表達

3 討論

PD 動物模型是研究PD 發病學和治療學重要的生物模式。目前建立PD 模型主要用藥物1-甲基-4-苯基-四氫吡啶(MPTP)或6-羥基多巴胺(6-OHDA)損毀DA 能神經元從而模擬PD 的病癥［13］。6-OHDA 建模致細胞損傷嚴重，模型穩定且持久，行為學表現典型［14］，MPTP 建模方法簡便，成功率較高但行為學不典型，但停藥后病理癥狀可逆。MFB 是通過下丘腦外側區的一束神經纖維，連接隔區、下丘腦和中腦的被蓋部位，黑質致密部的DA 神經元的軸突可以通過MFB 投射到紋狀體。本實驗借助立體定位儀單點注射6-OHDA 定向損毀MFB，成功建立了PD 大鼠模型。行為學動態觀察顯示，hAECs原位移植組大鼠于移植后2 w 開始，旋轉次數均明顯減少，且在觀察滿10 w 時未見反彈。

hAECs 在異基因宿體體內的存活及分化是學科界關注的重要問題。體外誘導培養研究證明，hAECs 在特定的誘導條件下可分化為神經元、膠質細胞和少突膠質細胞［15］。楊新新［16］報道hAECs 植入大鼠側腦室后表達TH，提示hAECs 可在病損腦組織分化成DA 能神經元。MAP-2 主要表達于成熟神經元的胞漿和樹突，TH 既是多巴胺合成的限速酶，也是DA 能神經元特異性標志之一，黑質TH 含量和活性降低及由此導致的DA 匱乏是PD 發病的主要環節［17］。本實驗采用免疫熒光和免疫組化染色觀察到hAECs 原位移植后12 w，大鼠腦損毀原位可見MAB1281 陽性細胞，說明移植的hAECs 至少可在模型動物腦組織內存活12 w 而未被排斥，這種免疫豁免特性與其不表達共刺激分子CD80(B7-1)和CD86 (B7-2)有關。進一步觀察發現部分MAB1281 陽性細胞表達MAP-2，腦損毀區TH 呈陽性，提示移植的hAECs 可在移植區分化成為多巴胺神經元樣細胞，hAECs 改善PD 模型大鼠運動行為可能與其促進黑質TH 表達有關。

hAECs 移植治療神經損傷的機制尚不明確。Palmatir 等［18］發現人、猴和鼠的羊膜組織中存在可溶性的促進神經細胞生長的物質，能促進培養的脊髓后跟神經節細胞生長。進一步的研究證明羊膜細胞含有胰島素樣生長因子、轉移生長因子、前列腺素、和表皮生長因子樣物質等因子，對神經元細胞起到營養作用［19～21］。hAECs 可通過分泌神經營養因子(Neurotrophic factors，NTFs)，NTFs 和可溶性炎癥抑制因子可緩解黑質多巴胺神經元的進行性退化和凋亡［22，23］，使病程得以緩解。至于由hAECs 分化而來的具有某些多巴胺能神經元特征的細胞是否起到了對PD 大鼠多巴胺能神經元的補償，并起到神經功能重建的作用，目前尚不清楚，除非能證明由供體細胞分化而來的神經元樣細胞之間及與宿主神經元之間確建立了新的神經元環路。這是值得深入研究的重要內容，對揭示細胞治療神經系統疾病的生物學機制具有重要意義。

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