高特異性聚合酶鏈反應(yīng)法鑒別大、小黃魚(yú)魚(yú)鰾及其混淆品

閻 婷，李 娜，賈景明，胡高升#（.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽(yáng) 006；2.遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧 錦州 200）

魚(yú)鰾又稱魚(yú)白、魚(yú)膠和魚(yú)肚，為石首魚(yú)科黃魚(yú)屬動(dòng)物大黃魚(yú)[Pseudosciaena crocea（Richardson）]、小黃魚(yú)（P.polyactisBleeker）或鱘科鱘魚(yú)屬動(dòng)物中華鱘（Acipenser sinensisGray）和鰉屬動(dòng)物鰉魚(yú)[Huso dauricus（Georgi）]等的魚(yú)鰾[1]。魚(yú)鰾作為貴重動(dòng)物藥材，不僅是筵席名菜，亦有很好的滋補(bǔ)作用和藥用價(jià)值，如滋陰養(yǎng)血、止血補(bǔ)血和補(bǔ)腎益精等[2-3]。由于魚(yú)鰾商品來(lái)源復(fù)雜，市場(chǎng)上混淆品較多，僅僅根據(jù)形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行鑒別魚(yú)鰾真?zhèn)我巡荒軡M足市場(chǎng)需求[4]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)鑒別中藥材的真?zhèn)我驯粡V泛認(rèn)可[5-7]。為了建立魚(yú)鰾藥材準(zhǔn)確鑒別方法，本研究采用高特異性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)對(duì)魚(yú)鰾藥材及其混淆品進(jìn)行了DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別。采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取8種供試品魚(yú)鰾的DNA，并對(duì)其線粒體12S rRNA 基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，為經(jīng)濟(jì)適用、準(zhǔn)確便捷和高穩(wěn)定性地鑒別魚(yú)鰾種屬來(lái)源提供依據(jù)，同時(shí)有利于魚(yú)鰾藥材的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

Hema 9600型梯度基因擴(kuò)增儀、TGL-16R/18R型冷凍高速冷凍離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；HE-120 型多功能水平電泳槽、EPS300型電泳儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 藥材

大、小黃魚(yú)魚(yú)鰾來(lái)源于市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的大黃魚(yú)、小黃魚(yú)、混淆品魚(yú)鰾來(lái)源于市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的青魚(yú)、鲅魚(yú)、鯉魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)和鯽魚(yú)，正品、混淆品均經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院賈景明教授鑒定為真品。

1.3 試劑

PCR 試劑盒、DNA MarkerⅢ均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；瓊脂糖（香港基因有限公司）；溴化乙錠（上海生工生物科技有限公司）；所用引物訂購(gòu)于生工生物工程（上海）有限公司。

2 方法

2.1 大、小黃魚(yú)魚(yú)鰾高特異性PCR鑒別引物的設(shè)計(jì)

從GenBank 下載大、小黃魚(yú)及混淆品青魚(yú)、鲅魚(yú)、鯉魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)、鯽魚(yú)的線粒體12S rRNA 基因序列（GenBank 登錄號(hào)依次為：FJ595214.1、FJ618559.1、NC_011141.1、NC_016420.1、AP009047.1、HQ891005.1、NC_010156.1、AB045144.1）。經(jīng)DNAMAN 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，分析正品、混淆品間DNA 序列差異，在差異較大區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，在保守序列處設(shè)計(jì)通用引物。大黃魚(yú)魚(yú)鰾的特異性引物為Fish-F1（5′-ATCAGGCACAACCAACCATAG-3′）和FishD-R1（5′-GACATGTATTTCAGTATGTCA-3′）；小黃魚(yú)魚(yú)鰾的特異性引物為Fish-F1和FishX-R2（5′-GACATGTGTTTCAGCATGTTA-3′）。通用引物及 序 列 為：Univ-F（5′-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3′）和Univ-R（5′-GAGAGTGACGGGCGGTGTGT-3′）。大、小黃魚(yú)及其混淆品12S rRNA部分序列見(jiàn)圖1（實(shí)線箭頭部分為特異性引物，虛線箭頭部分為通用引物）。

圖1 大、小黃魚(yú)及其混淆品12S rRNA部分序列Fig 1 Multiple alignment of 12S rRNA sequences of P.crocea，P.polyactis and their adulterants

2.2 模板DNA的提取

取大、小黃魚(yú)及混淆品青魚(yú)、鲅魚(yú)、鯉魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)和鯽魚(yú)的魚(yú)鰾組織約50 mg，采用CTAB 法[8]提取基因組總DNA，并稍作改進(jìn)。將供試品魚(yú)鰾組織分別置于研缽中，加液氮研磨成粉末狀。在1.5 ml 離心管中分別加入1 ml 65 ℃預(yù)熱CTAB裂解液[CTAB 2%，Tris-HCl 100 mmol/L，乙二胺四乙酸（EDTA）10 mmol/L，NaCl 1.4 mol/L，用前加2%β-巰基乙醇]，將研磨成粉的魚(yú)鰾組織迅速加入該離心管中，充分混勻后置65 ℃水浴1 h，期間每隔20 min 顛倒振蕩1 次。水浴結(jié)束后，在離心管中加500 μl 氯仿-異戊醇（24 ∶1，V/V），振蕩后以離心半徑為12 cm、12 000 r/min 離心15 min。取上清液，加等體積異丙醇，搖勻后室溫靜置5 min，以離心半徑為12 cm、12 000 r/min 離心5 min，棄上清液，得到DNA 沉淀，加入750 μl 75%乙醇洗滌2 次，沉淀風(fēng)干后溶于20 μl TE 緩沖液中，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，－20 ℃貯藏，備用。

2.3 高特異性PCR鑒別方法

PCR 反應(yīng)體系10 μl，其中10×PCR 無(wú)Mg2+的緩沖液1 μl，高純dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μl，Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.1 μl，MgCl2（25 mmol/L）0.8 μl，引物Fish-F1、FishD-R1 或引物Fish-F1、FishX-R2 各0.2 μl（10 μmol/L），模板1 μl，無(wú)菌水5.9 μl。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。選用不同的復(fù)性溫度以尋找合適的PCR 鑒別反應(yīng)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置不含DNA模板的陰性對(duì)照。取2 μl 反應(yīng)液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠熒光（EB）染色，紫外分析檢測(cè)，成像。同時(shí)用擴(kuò)增約420 bp 的12S rRNA 基因片段的通用引物Univ-F 和Univ-R 在55 ℃的復(fù)性溫度下對(duì)上述用于PCR 鑒別的模板DNA作陽(yáng)性擴(kuò)增對(duì)照。

3 結(jié)果

3.1 模板質(zhì)量的檢測(cè)

大、小黃魚(yú)魚(yú)鰾及混淆品提取的DNA 模板用通用引物Univ-F 和Univ-R擴(kuò)增，得到約420 bp擴(kuò)增帶，與理論預(yù)測(cè)大小一致，表明樣品中模板DNA 質(zhì)量符合PCR反應(yīng)的要求。通用引物Univ-F 和Univ-R 擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖2。

圖2 通用引物Univ-F 及Univ-R 擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖M.DNA marker；1.大黃魚(yú)；2.小黃魚(yú)；3.青魚(yú)；4.鲅魚(yú)；5.鯉魚(yú)；6.鰱魚(yú)；7.草魚(yú)；8.鯽魚(yú)Fig 2 Agarose gel electrophoresis of PCR product using general primer Univ-F and Univ-RM.DNA marker；1. P.crocea；2. P.polyactis；3. Mylopharyngodon piceus；4. Scomberomorus niphonius；5. Cyprinus carpio；6. Hypophthalmichthys molitrix；7. Ctenopharyngodon idellus；8. Ctenopharyngodon idellus

3.2 高特異性PCR鑒別

3.2.1 大黃魚(yú)魚(yú)鰾 用大黃魚(yú)魚(yú)鰾特異性引物PCR 擴(kuò)增8種供試魚(yú)鰾的DNA，當(dāng)復(fù)性溫度分別為50.7 ℃和55.5 ℃時(shí)，大黃魚(yú)魚(yú)鰾和小黃魚(yú)魚(yú)鰾均有1條帶；當(dāng)復(fù)性溫度升至60.4 ℃、30個(gè)循環(huán)時(shí)，其反應(yīng)具有高度特異性，僅大黃魚(yú)魚(yú)鰾有良好的單一擴(kuò)增帶，其余樣品皆無(wú)擴(kuò)增帶出現(xiàn)。故特異性PCR 循環(huán)參數(shù)確定為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60.4 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。經(jīng)PCR 循環(huán)，得670 bp 的擴(kuò)增帶。因此，依據(jù)鑒別引物擴(kuò)增模板DNA有無(wú)擴(kuò)增條帶即可確定受試樣品是否為大黃魚(yú)魚(yú)鰾。大黃魚(yú)魚(yú)鰾特異性引物Fish-F1 及FishD-R1 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖3。

圖3 大黃魚(yú)魚(yú)鰾特異性引物Fish-F1 及FishD-R1 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖M.DNA marker；1.大黃魚(yú)；2.小黃魚(yú)；3.青魚(yú)；4.鲅魚(yú)；5.鯉魚(yú)；6.鰱魚(yú)；7.草魚(yú)；8.鯽魚(yú)；9.陰性對(duì)照Fig 3 Agarose gel electrophoresis of PCR product using specific primers Fish-F1 and FishD-R1 of swimming bladder of P.croceaM.DNA marker；1. P.crocea；2. P.polyactis；3. Mylopharyngodon piceus；4.Scomberomorus niphonius；5.Cyprinus carpio；6.Hypophthalmichthys molitrix；7. Ctenopharyngodon idellus；8. Ctenopharyngodon idellus；9.negative control

3.2.2 小黃魚(yú)魚(yú)鰾 用小黃魚(yú)魚(yú)鰾特異性引物PCR 擴(kuò)增8種供試魚(yú)鰾的DNA，當(dāng)復(fù)性溫度分別為61 ℃和62.4 ℃時(shí)，大黃魚(yú)魚(yú)鰾和小黃魚(yú)魚(yú)鰾均有1條帶；當(dāng)復(fù)性溫度升至64.8 ℃、30個(gè)循環(huán)時(shí)，其反應(yīng)具有高度特異性，僅小黃魚(yú)魚(yú)鰾有良好的單一擴(kuò)增帶，其余樣品皆無(wú)擴(kuò)增帶出現(xiàn)。故特異性PCR 循環(huán)參數(shù)確定為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，64.8 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。經(jīng)PCR循環(huán)，得670 bp 的擴(kuò)增帶。因此，依據(jù)鑒別引物擴(kuò)增模板DNA 有無(wú)擴(kuò)增條帶即可確定受試樣品是否為小黃魚(yú)魚(yú)鰾。小黃魚(yú)魚(yú)鰾特異性引物Fish-F1 及FishX-R2 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖4。

4 討論

本研究運(yùn)用CTAB法提取了8種供試魚(yú)鰾的DNA，該方法操作簡(jiǎn)便、快捷，且能夠滿足PCR需要。

圖4 小黃魚(yú)魚(yú)鰾特異性引物Fish-F1 及FishX-R2 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖M.DNA Marker；1.小黃魚(yú)；2.大黃魚(yú)；3.青魚(yú)；4.鲅魚(yú)；5.鯉魚(yú)；6.鰱魚(yú)；7.草魚(yú)；8.鯽魚(yú)；9.陰性對(duì)照Fig 4 Agarose gel electrophoresis of PCR product using specific primers Fish-F1 and FishX-R2 of swimming bladder of P.polyactisM.DNA marker；1. P.polyactis；2. P.crocea；3. Mylopharyngodon piceus；4. Scomberomorus niphonius；5. Cyprinus carpio；6. Hypophthalmichthys molitrix；7. Ctenopharyngodon idellus；8. Ctenopharyngodon idellus；9.negative control

為實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒別魚(yú)鰾真?zhèn)蔚哪康模狙芯繉ふ沂袌?chǎng)上充偽頻率高、價(jià)格低廉、外觀形態(tài)上與大、小黃魚(yú)相近的品種進(jìn)行了PCR鑒別。結(jié)果表明，運(yùn)用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒別大、小黃魚(yú)魚(yú)鰾和其他混淆品，為魚(yú)鰾藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。研究還發(fā)現(xiàn)，若將這兩對(duì)特異性引物分別配成鑒別試劑盒，PCR 時(shí)只需加入模板，反應(yīng)完成后即可直接電泳，使鑒別反應(yīng)更加簡(jiǎn)化、便捷，可為各級(jí)藥檢所鑒定藥材真?zhèn)翁峁﹨⒖肌?/p>

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