海參精囊兩種提取物對環磷酰胺誘導的小鼠睪丸氧化損傷的保護作用

郭錫春，高 華，劉 坤，劉占濤，張 婕，高 文，劉春寶，吳巖強（1.濰坊醫學院附屬醫院藥劑科，山東濰坊 6101；.青島大學藥學院，山東青島 6601；.青島大學臨床醫學院，山東青島 6601；.大連棒棰島海產股份有限公司，遼寧大連 116100）

近年來，有關自由基在各種疾病發病機制中的作用日益受到重視。研究表明，自由基損傷機制與環磷酰胺（Cyclophosphamide，CP）引起的生精功能障礙有密切關系[1]。含氧自由基及其產物會利用機體的脂質過氧化作用影響細胞的正常生理功能，甚至引起細胞死亡[2]。

海參作為人們熟知的海中珍品，具有較高的營養價值，其含有的多種活性成分已被證實具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、提高免疫力及延緩衰老的藥理作用[3-4]。海參精囊為海參的生殖器官，也具有較高的營養價值。因此本實驗通過建立衰老的動物模型，利用不同劑量的海參精囊提取物飼養小鼠，檢測提取物對小鼠睪丸的總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性和丙二醛（MDA）水平的影響，同時觀察睪丸和附睪的臟器指數變化，以探討海參精囊提取物對CP誘導的小鼠睪丸氧化損傷的保護作用。

1 材料

1.1 儀器

AR5120 型電子天平（奧豪斯國際貿易上海有限公司）；DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SK3200H 型超聲波清洗機（上海科導超聲儀器有限公司）；冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；LD4-2A型低速離心機（北京雷勃爾離心機有限公司，離心半徑：5 cm）；723N 型可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 藥材

海參精囊由大連棒棰島海產股份有限公司提供，所用海參為刺參（Stichopus japonicus），由中國科學院海洋研究所段德麟研究員鑒定。

1.3 藥品與試劑

0.9%氯化鈉（NaCl）溶液（辰欣藥業股份有限公司，批號：1207215121）；甲睪酮片（上海信誼康捷藥業有限公司，批號：110802，規格：5 mg/片）；注射用CP（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：12031425，規格：0.2 g/瓶）；總蛋白定量測試盒、TSOD 測試盒、GSH-PX 測試盒、MDA 測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20130604、20130603、20130525、20130605）。

1.4 動物

2 方法

2.1 提取物的制備

2.1.1 海參精囊水提物 稱取一定量海參精囊，用組織勻漿器打碎，按質量比1∶3加入蒸餾水，采用超聲波輔助提取，超聲溫度30 ℃，超聲時間25 min，然后水浴30 ℃條件下攪拌提取2 h，并以4 000 r/min 離心5 min，取上清液；沉淀物按質量比1 ∶2加入蒸餾水，重復上述操作，合并上清液，通過快速定性濾紙濾過，濾液旋蒸濃縮至1/3時，進行冷凍干燥得到粗提物。

2.1.2 海參精囊醇提物 將預凍好的海參精囊進行冷凍干燥，然后稱取一定量，粉碎，按質量比1 ∶10 加入無水乙醇，30 ℃條件下攪拌提取3 h，濾過后取濾液；殘渣按質量比1∶5加入無水乙醇，重復上述操作，合并濾液，采用旋轉蒸發儀進行濃縮并回收乙醇，濃縮液進行真空干燥得到浸膏。

2.2 動物模型制備及分組、給藥

108 只小鼠隨機分成9 組，每組12 只，空白組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其他各組均腹腔注射CP（28 mg/kg），連續5 d 以復制動物雄激素部分缺乏、生殖系統受損模型；同時灌胃給予相應的藥物：海參精囊水提物和醇提物各組分別給予海參精囊水提物[150、300、600 mg（生藥）/kg]、海參精囊醇提物[150、300、600 mg（生藥）/kg]，陽性對照組灌胃甲睪酮溶液（1.5 mg/kg），空白組和模型組灌胃同體積的蒸餾水，連續4周。

2.3 指標的測定

在小鼠飼養過程中，每組會有1～2 只死亡。為方便進行統計學描述，故統一測定10只小鼠的指標。末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，立即去雙側睪丸和附睪稱質量，觀察睪丸、附睪臟器指數的變化（睪丸、附睪與體質量的比值）。另取右側睪丸組織，按質量（g）∶體積（ml）＝1 ∶9的比例加入9倍體積的0.9%氯化鈉溶液，冰水浴條件下勻漿，制備成10%的勻漿液，2 500～3 000 r/min離心10 min，取上清液嚴格按照試劑盒說明書方法檢測。睪丸組織總蛋白含量用考馬斯亮藍法測定，T-SOD 活性采用羥胺法測定，GSH-PX 活性采用比色法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 海參精囊提取物對小鼠臟器指數的影響

與空白組比較，模型組小鼠的睪丸及附睪的臟器指數明顯減小，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組比較，給藥各組小鼠的臟器指數均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；其中，附睪質量和附睪指數呈現出量效關系，結果見表1。

表1 海參精囊提取物對小鼠臟器指數的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of holothurian spermatophore extracts on viscera indexes of mice（，n＝10）

表1 海參精囊提取物對小鼠臟器指數的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of holothurian spermatophore extracts on viscera indexes of mice（，n＝10）

注：與空白組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.2 相關氧化指標的檢測

3.2.1 睪丸組織蛋白濃度的檢測結果 模型組小鼠經CP 處理后，睪丸組織中蛋白濃度明顯降低，與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，給藥各組小鼠的睪丸組織蛋白濃度均升高（P＜0.01或P＜0.05），結果見表2。

3.2.2 T-SOD的檢測結果 連續應用5 d CP，導致小鼠睪丸組織中T-SOD 含量顯著降低；而海參精囊兩種提取物均逆轉了T-SOD的下降，使組織內T-SOD含量顯著回升，均接近或超過空白組水平，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），結果見表2。

表2 海參精囊提取物對小鼠睪丸組織抗氧化能力的影響（，n＝10）Tab 2 Effects of holothurian spermatophore extracts on anti-oxidative capacity of testis（，n＝10）

表2 海參精囊提取物對小鼠睪丸組織抗氧化能力的影響（，n＝10）Tab 2 Effects of holothurian spermatophore extracts on anti-oxidative capacity of testis（，n＝10）

注：與空白組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.2.3 GSH-PX 的檢測結果 經檢測，連續5 d 注射CP，使睪丸組織中GSH-PX顯著下降，模型組與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；海參精囊兩種提取物的使用顯著提高了組織中GSH-PX 的水平，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），結果見表2。

3.2.4 MDA的檢測結果 CP處理后，模型組小鼠睪丸組織中MDA含量顯著上升，其變化趨勢與T-SOD和GSH-PX相反，與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。海參精囊兩種提取物均顯著降低睪丸組織中MDA含量，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），結果見表2。

4 討論

“自由基”學說是國內外研究的衰老理論的一種，最早是由Denham Harman 于1955 年提出的：氧自由基在機體的氧化代謝過程中不斷產生，然后與核酸蛋白質和脂肪等物質反應，生成相應的氧化物和過氧化物[5-6]。在正常生理條件下，機體的氧化和抗氧化系統維持在動態平衡條件下，生物體內的自由基不斷產生，也不斷被抗氧化系統清除[7]。機體的抗氧化系統主要包括酶促和非酶促兩個體系，其中酶促防御系統是通過體內的各種抗氧化酶來抑制不同自由基和活性氧的產生，包括SOD、GSH-PX和過氧化氫酶（CAT）。SOD是歧化超氧陰離子（O2－）的專一性酶，由于O2－是活性氧生成過程中的初始產物，并對GSH-PX、CAT 將H2O2轉化為H2O 的反應具有催化作用，因此，SOD 被稱作活性氧防御的第一線。GSH-PX 和CAT 主要起到后背支持的作用，其活性高低均反映出機體內抗氧化水平。另外，MDA是氧自由基引起的脂質過氧化反應產生的主要最終代謝產物，可以用來作為衡量氧化應激程度的指標[8-9]。

隨著年齡增加，機體清除自由基的能力降低，打破了氧化抗氧化系統的平衡，主要表現為氧化作用增強、抗氧化能力減弱、自由基過量而產生過氧化脂肪，從而引起機體的損傷[10]。本實驗發現，模型組小鼠睪丸組織T-SOD、GSH-PX 活性和睪丸、附睪指數顯著降低，MDA水平顯著升高，提示CP可以導致睪丸組織細胞中氧自由基生成增多。T-SOD 和GSH-PX 被大量消耗，不能使過量生成的自由基得以清除，從而加重了脂質過氧化程度，使氧化和抗氧化系統失衡、生殖細胞損傷及代謝障礙，進而損傷生殖系統，使小鼠的睪丸和附睪萎縮。與模型組比較，給藥各組小鼠睪丸組織T-SOD、GSH-PX活性和睪丸、附睪指數顯著增高，MDA 水平明顯降低，說明海參精囊提取物能很好地降低睪丸組織MDA 水平，防止氧自由基損傷，提高睪丸組織T-SOD 活性和GSH-PX 活性，提高組織細胞抗氧化和清除自由基的能力，從而維持細胞內氧化抗氧化系統的平衡，減輕機體受自由基損傷的程度，對抗衰老小鼠睪丸和附睪的萎縮。

本研究發現，CP可以使睪丸組織脂質過氧化水平上升、超氧化反應加強，這可能是造成睪丸損害的途徑之一，但也無法排除與非酶促防御系統存在失衡有關。海參精囊兩種提取物對CP誘導的小鼠睪丸氧化損傷有保護作用。

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