唐草片對依非韋倫在大鼠體內藥動學的影響Δ

張麗軍，姚亞敏，賈小芳，尹 林，劉曉茜，沈銀忠，盧洪洲，程能能（.上海市公共衛生臨床中心，上海 20508；2.復旦大學藥學院，上海 200032）

目前艾滋病（AIDS）的治療方法主要為抗病毒治療[1]。然而，發展中國家的患者由于經濟問題或其他臨床癥狀，常用中草藥進行輔助甚至替代治療[2-5]。根據一份來自烏干達（Uganda）的報道：63.5%的人類獲得性免疫病毒（HIV）陽性患者使用過中草藥，同時使用抗病毒藥物和中草藥者占32.8%。在中國，唐草片是唯一一個被國家食品藥品監督管理總局（CFDA）批準用于HIV 感染者的藥物[6]，正被越來越多的患者所使用。當唐草片與抗病毒藥物同時使用時，唐草片能清除氧自由基[7]，用于HIV 感染者以及AIDS 患者（CD4 淋巴細胞在100～400個/mm3之間），有提高CD4淋巴細胞計數的作用，可改善乏力、脫發、食欲減退和腹瀉等癥狀，改善活動功能狀況。然而唐草片成分非常復雜，其對抗病毒藥物的影響令人擔憂。為了降低潛在的藥物-藥物相互作用，藥廠建議服用抗病毒藥物60 min 后服唐草片。本課題組也通過臨床試驗驗證了兩者服用相隔60 min后唐草片不會影響抗病毒藥物血藥濃度的結論[8]。但如果兩藥同時服用將極大地方便患者，提高患者的服藥依從性。為此，本研究在大鼠模型中研究唐草片與依非韋倫（EFV）同時服用時，唐草片對EFV藥動學的影響，以為臨床用藥提供指導。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；API-3200型質譜儀（美國Biosystems公司）。

1.2 藥品與試劑

EFV對照品（美國USP公司，批號：1234103，純度：99.8%，規格：200 mg/瓶）；替米沙坦（內標，北京柏雅方舟醫藥科技有限公司，批號：040511，純度：99.5%，規格：500 mg/瓶）；EFV片（美國Merck 公司，批號：S2520，規格：600 mg/片）；唐草片（上海百歲行藥業有限公司，批號：090301，規格：400 mg/片）；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為Millipore 超純水。

1.3 動物

2 方法與結果[9-12]

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），預柱C18（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液-甲醇（20∶80，V/V），流速：0.5 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：多反應監測（MRM）；噴霧氣壓：35 psi；霧化器溫度：550 ℃；氣流速度：10 L/min；掃描時間為10 min。用于定量反應的離子對分別為內標替米沙坦：m/z515.2→276.2，EFV：m/z316.0→243.9。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取EFV對照品9.60 mg，用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，制備成EFV質量濃度分別為750、1 500、3 000、6 000、12 000、24 000、48 000、96 000 ng/ml的對照品系列溶液，4 ℃貯藏，備用。

2.3.2 內標溶液的制備 精密稱取替米沙坦10.85 mg，用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，制備成質量濃度為1.080 mg/ml的內標溶液，用50%甲醇稀釋制備內標工作液質量濃度為100 ng/ml，4 ℃貯藏，備用。

2.3.3 質控樣品的制備 分別取不同質量濃度的對照品系列溶液10 μl 與100 ng/ml 內標溶液10 μl，加入100 μl 空白血漿中，制得質量濃度為1 500、3 000、7 680 ng/ml質控樣品（即高、中、低質量濃度的質控樣品），－80 ℃貯藏，備用。

2.4 血漿樣品的處理

精密吸取大鼠血漿樣品100 μl，置于1.5 ml 離心管中，加入50%甲醇10μl、100 ng/ml內標溶液10 μl、1 ml乙酸乙酯，渦旋混合5 min，以13 400×g離心10 min，吸取上清液（乙酸乙酯層）至另一1.5 ml 離心管中；下層溶液用1 ml 乙酸乙酯按上述方法再提取1 次，上清液合并至相應離心管中，37 ℃氮氣吹干，殘渣用100 μl 流動相復溶，渦流混合，取上清液10 μl進樣。

2.5 方法學考察

2.5.1 方法專屬性 分別取EFV 對照品、內標、空白血漿、空白血漿+EFV對照品（24 000 ng/ml）、給藥后60 min大鼠血漿，按“2.4”項下方法處理樣品后，按“2.1”“2.2”項下色譜、質譜條件進樣測定。結果表明，血漿中內源性物質以及EFV 的可能代謝產物不干擾EFV 和內標的測定。質譜見圖1；液相色譜-串聯質譜見圖2。

圖1 質譜圖A.內標；B.EFV對照品Fig 1 The mass spectrometry profilesA.internal standard；B.EFV control

圖2 液相色譜-串聯質譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+EFV對照品；C.給藥60 min后大鼠血漿；1.內標；2.EFVFig 2 LC-MS/MSA.blank plasma；B.blank plasma+EFV control；C.plasma 60 min after administration；1.internal standard；2.EFV

2.5.2 標準曲線的制備 按“2.3”項下方法制備對照品溶液，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下色譜、質譜條件進樣測定。以EFV質量濃度（x）為橫坐標、峰面積積分值和內標峰峰面積之比（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝1.79×10－5x+2.12×10－5（r＝0.993 2）。結果表明，EFV 質量濃度在75.0～9 600 ng/ml 范圍內與峰面積積分值和內標峰峰面積之比呈良好線性關系。

2.5.3 準確度與精密度試驗 按“2.3”項下方法制備高、中、低質量濃度的質控樣品各5 份，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下色譜、質譜條件考察日內精密度（5次）、日間精密度（3 d）、準確度（5次）。結果，3種質量濃度的質控樣品日內、日間RSD＜10%，準確度在92.1%～102.0%之間，表明該試驗方法符合目前生物樣品分析方法指導原則中的有關規定。精密度與準確度試驗結果見表1。

表1 精密度與準確度試驗結果Tab 1 Results of precision test and accuraly

2.5.4 提取回收率試驗 按“2.3”項下方法制備高、中、低質量濃度的質控樣品各5 份，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下色譜、質譜條件進樣測定。測得峰面積后與同質量濃度對照品溶液直接進樣所得峰面積進行比較，計算提取回收率。結果顯示，高、中、低質量濃度的質控樣品有著一致的回收率。提取回收率試驗結果見表2。

表2 提取回收率試驗結果（n＝5，%）Tab 2 Results of the extraction recovery test（n＝5，%）

2.5.5 穩定性試驗 取“2.3”項下高、中、低質量濃度的質控樣品各6 份，置于4 ℃保存24 h 后測定，考察血漿樣品的短期穩定性；取“2.3”項下高、中、低質量濃度的質控樣品各6份，冷凍貯藏于－80 ℃，30 d 后測定，考察血漿樣品的長期穩定性；取“2.3”項下高、中、低質量濃度的標準質控樣品各6 份，冷凍貯藏于－80 ℃，在室溫中充分解凍，然后再次冷凍，每次間隔24 h，重復3個凍融周期后測定，考察血漿樣品的3個周期的凍融穩定性。結果，被測物在上述保存條件下測得實際值均在理論值的85%～115%范圍波動，RSD＜10.0%，表明EFV 在血漿樣品中穩定性良好。穩定性試驗結果見表3。

表3 穩定性試驗結果（，n＝6，%）Tab 3 Results of stability Test（，n＝6，%）

表3 穩定性試驗結果（，n＝6，%）Tab 3 Results of stability Test（，n＝6，%）

2.5.6 基質效應 取6份不同來源的大鼠空白血漿100 μl，經液-液萃取處理后，加入內標和不同質量濃度的混合溶液，制得高、中、低質量濃度的血漿樣品（質量濃度與“2.3.3”項下相同），內標終質量濃度為10 ng/ml；另取流動相100 μl代替空白血漿，按“2.3”項下方法處理。按“2.1”“2.2”項下色譜、質譜條件進樣測定，將測得的相應峰面積相比評價基質效應。結果，比值均在93.1%～101.2%之間，RSD＜15%，表明大鼠血漿生物基質不影響樣品測定。

2.6 藥動學研究

18 只SD 大鼠隨機均分為3 組，分別單獨ig 給予EFV（54 mg/kg，即EFV 組）、同時ig 給予EFV 和唐草片（54 mg/kg+864 mg/kg，即EFV-0T 組）、ig 給予EFV60 min 后ig 給予唐草片（54 mg/kg +864 mg/kg，即EFV-60T 組）。用藥劑量按照人體（以60 kg計）與大鼠的每1 kg體質量劑量折算系數6.25進行計算，EFV臨床用藥劑量為600 mg/次、唐草片為3 200 mg/次，tid；此外適當考慮大鼠的給藥體積，最后確定EFV 和唐草片的用藥劑量分別為54、864 mg/kg。于大鼠ig 給藥前與末次給藥后0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、9.0、12.0、24.0 h 頸動脈取血，測定不同時間血藥濃度，用DAS 2.0 軟件分析計算藥動學參數。采用SPSS 16.0軟件處理實驗數據。數據以表示；多組間比較先用單因素分析其正態分布，后以雙向獨立變量樣品檢測（Two-independent-samples tests）中的Mann-WhitneyU法進行統計。P＜0.05為差異有統計學意義。

與EFV組相比，EFV-0T組大鼠體內EFV的血藥濃度上升緩慢，但是EFV-60T組的EFV血藥濃度-時間的曲線與EFV組基本一致。與EFV 組相比，EFV-0T 組EFV 的AUC0-∞和t1/2降低了近1 倍，MRT0-∞降低，CL/F明顯提高。但是EFV-60T 組EFV 的藥動學參數與EFV 組一致，差異無統計學意義（P＞0.05）。在各組大鼠的tmax、cmax、V/F差異無統計學意義（P＞0.05）。EFV 血藥濃度-時間曲線見圖3；EFV 藥動學參數見表4。

圖3 EFV血藥濃度-時間曲線Fig 3 Plasma concentration-time curve of EFV

表4 EFV藥動學參數（，n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameters of EFV（，n＝6）

表4 EFV藥動學參數（，n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameters of EFV（，n＝6）

注：與EFV組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.EFV group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 討論

AIDS 患者有各種并發癥，中藥有利于患者的治療[13]。但是中草藥含有多種活性成分，且通常作用機制不明，使得中草藥-西藥的相互作用在所難免，可能會給患者帶來危險[14-15]。為了降低唐草片對抗病毒藥物的影響，臨床上推薦服用抗病毒藥物60 min 后服用唐草片。這種服用間隔給患者工作、生活帶來不便，影響患者的依從性。因此，本研究在大鼠模型中比較同時ig給予EFV和唐草片或者ig給予EFV 60 min后再ig給予唐草片對大鼠體內EFV 血藥濃度的影響。通過LC-MS/MS測定各組大鼠中EFV的血藥濃度，發現EFV和唐草片同時服用明顯降低了EFV 的血藥濃度，因此建議至少要在服用EFV 60 min后再服用唐草片。

本研究首次在大鼠模型中比較研究不同的唐草片服藥時間對EFV藥動學參數的影響，但其具體機制仍需深入研究。

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