中藥聯合干細胞移植對缺血再灌注大鼠腦內GDNF的影響

鄧秀君

實驗研究

中藥聯合干細胞移植對缺血再灌注大鼠腦內GDNF的影響

鄧秀君

目的研究應用骨髓單個核細胞(BMNC)、骨髓間充質干細胞(BMSC)蛛網膜下腔移植聯合中藥蝮龍抗栓丸對缺血再灌注(MCAO)腦損傷大鼠腦內膠質細胞源性神經生長因子(GDNF)的影響。方法140只Wistar雄性大鼠隨機分為七組：中藥聯合BMSC組、BMSC組、中藥聯合BMNC組、BMNC組、模空組、假手術組、正常組, 每組20只, 分析其不同干預方法。治療干預后4、28 d應用定量酶聯免疫吸附法(ELISA)測定各組實驗大鼠腦組織內GDNF的含量。結果中藥聯合BMNC組 和中藥聯合BMSC組較其他組在移植4 d和28 d均能上調腦組織內GDNF水平(P＜0.05), 且4 d時中藥聯合BMNC組上調能力更強(P＜0.05)。結論中藥分別與兩種細胞聯合均可顯著上調GDNF水平；中藥聯合BMNC在移植早期上調GDNF的效果更明顯, 移植后期兩者效果趨同。

蝮龍抗栓丸；膠質細胞源性神經生長因子；細胞移植；骨髓間充質干細胞；骨髓單個核細胞

缺血性腦卒中是神經病學中的常見病、多發病, 致殘率高, 越來越受到人們的重視。骨髓源細胞通過自分泌或旁分泌神經營養因子(NTF), 促進血管增生, 保護神經組織, 減少細胞凋亡, 增加腦室周圍的內源性神經干細胞及祖細胞的增殖和分化[1], 為內源性和外源性干細胞存活和分化提供有利的微環境, 使受損腦組織達到功能恢復的目的。作者應用定量ELISA方法檢測缺血再灌注(middle cerebral arterial occlusion, MCAO)腦損傷大鼠腦組織中GDNF含量, 并通過比較含量的變化分析骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)和骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells, BMNC)移植合并中藥治療作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠, SPF/VAF級, 共計150只。其中3～4個月齡, 平均體質量(280±20)g, 雄性,140只；3～4周齡,70～90 g, 雄性,10只(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。主要試劑：胎牛血清、培養基L-DMEM、0.25％胰酶(美國GIBCO公司)；大鼠淋巴細胞分離液(中國醫學科學院生物工程研究所)；0.9％生理鹽水(沈陽北方制藥廠)。蝮龍抗栓丸(沈陽市第二中醫醫院, 主要成分為天麻、菖蒲、黃芪、丹參、川芎、蝮蛇等)。

1.2 實驗方法

1.2.1 骨髓細胞的分離培養 Wistar大鼠,3～4周齡,10％水合氯醛腹腔麻醉, 無菌條件取出雙側股骨、脛骨。磷酸緩沖液(PBS)反復沖洗剪掉兩端的骨髓腔。離心, 得到中間單層細胞。將分離得到的細胞中加入含10％胎牛血清的L-DMEM培養基,5％ CO2、37℃、飽和濕度下培養。24 h后更換培養液, 每3天更換新培養液。鏡下觀察細胞生長達80％～90％時, 用0.25％胰蛋白酶消化備用。

1.2.2 動物分組與干預 Wistar雄性大鼠,3～4個月齡,140只隨機分為七組：中藥聯合BMSC組、BMSC組、中藥聯合BMNC組、BMNC組、模空組、假手術組、正常組, 每組20只。因手術意外等原因, 最終納入112只, 平均每組16只。術后24 h將細胞移植到蛛網膜下腔并行中藥灌胃治療,1次/d。4、28 d取大鼠損傷側腦組織。

1.2.3 大鼠腦損傷模型建立 按照Longa等[2]改良線栓法,建立大鼠大腦中動脈栓塞2 h再灌注模型：取雄性Wistar大鼠,3～4個月齡, 腹腔麻醉。分離暴露右側頸總動脈(CCA),頸內動脈(ICA), 頸外動脈(ECA), 在根部結扎ECA, 結扎CCA,在CCA近頸外、頸內分叉處剪一小口, 將5 cm的末端燒成圓頭尼龍線緩慢送入ICA, 深度約為(18±2)mm, 結扎ICA, 在大腦中動脈(MCA)起始端堵塞血流。2 h后, 抽出尼龍線, 恢復灌注。大鼠蘇醒后進行神經損傷嚴重程度評分(NSS), >6分為造模成功, 其他予以剔除。正常組大鼠不做處理, 假手術組大鼠操作至暴露ICA、ECA。

1.2.4 蛛網膜下腔移植骨髓細胞 將直接分離獲得的BMNCs或原代培養的BMSC單細胞懸液, 在MCAO模型大鼠造模24 h后, 從枕骨大孔處將細胞以1 μl/min進行蛛網膜下腔注射。模空組以0.01 MPBS代替。移植細胞體積為100 μl, 總數為2×107個。

1.3 實驗取材與指標測定10％水合氯醛麻醉大鼠。取右側后半球, 勻漿并稀釋。美國ADL.inc.BDNF定量ELISA檢測試劑盒, 參照試劑盒測試步驟進行, 濃度單位1.0 pg/ml。利用微板酶標測定儀進行數據測定, 讀取波長450 nm處OD值, 并將測量值所測值按標準曲線換算。

1.4 統計學方法 采用PEMS3.1軟件處理相關數據。計量資料以均數 ± 標準差(±s)表示, 采用t檢驗。設定檢驗水平α=0.05, P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

按相應標準曲線換算成GDNF含量,4、28 d時各組大鼠腦組織中GDNF含量比較, 見表1。

表1 4、28 d各組大鼠腦組織中GDNF含量比較(±s, pg/ml)

表1 4、28 d各組大鼠腦組織中GDNF含量比較(±s, pg/ml)

注：與其他各組比較,aP<0.05；干預4 d時與中藥聯合BMSC組比較,bP<0.05 ；同組干預4 d時與干預28 d時比較,cP<0.05

組別 N只數 4 d 28 d正常組假手術組模型組BMNC組中藥聯合BMNC組BMSC組中藥聯合BMSC組16161616161616122.26±16.90125.92±18.19139.07±19.51194.21±39.56560.61±194.84abc169.83±28.84370.93±46.19ac53.46±3.9153.00±4.5762.60±4.0567.70±4.73247.83±99.58a82.66±32.23247.34±98.02a

3 討論

3.1 骨髓間充質干細胞的自分泌與旁分泌 腦缺血損傷可引起腦內各種神經營養因子的分泌增加[3], BMSC移植會明顯提高多種NTF的分泌。BMSC分泌的營養因子, 能夠對腦缺血后的功能障礙起到改善, 促進局部組織血管再生和功能恢復；BMSC可分泌白細胞介素、巨噬細胞集落刺激因子、Rt,3配體及干細胞因子等； BMSC能夠合成細胞外基質, 如纖維連接蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白, 還可以合成集落刺激因子、骨形成蛋白及造血調節因子等；BMSC還可分泌和釋放兒茶酚胺和特殊的神經遞質。

BMSC也可形成旁分泌效應, 影響腦組織的內分泌功能。移植的BMSC可增加腦內生長因子的表達, 使宿主腦組織內的生長因子含量增加, 減少神經細胞的凋亡, 提供適宜的微環境促進修復神經組織和重建功能；此外, BMSC可提供某種促分化因子改善損傷腦組織, 促進神經干細胞和前體細胞的增殖、遷移、分化和成熟, 生成新的神經元和膠質細胞,促進神經功能的改善[1]。

3.2 中藥聯合骨髓干細胞移植對MCAO腦內GDNF的影響GDNF在促進中樞神經細胞生長、營養神經元方面作用明顯, 是具有抗神經元凋亡和阻止神經細胞萎縮的唯一已知的因子。

GDNF因子在腦缺血再灌注后表達量的上調可能是因為構成炎癥過程的某個組成部分參與到神經元自身保護機制中, GDNF在腦缺血急性期損傷之后的表達下調可能與停止引起基因表達微弱或能量代謝較低有關, 考慮這種表達的時程差異與動物種屬及缺血模型有關。

總之, 中藥分別與兩種細胞聯合均可顯著上調GDNF水平；中藥聯合BMNC在移植早期上調GDNF的效果更明顯,移植后期兩者效果趨同。

[1]Chen CG, Li Y, Wang L, et al. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production. Neuropathology,2002,22(4):275-279.

[2]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke,1989,20(1):84-91．

[3]Kirmaird T, Stabile E, Bumett MS, et al. Loeal delivery of marrowderived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms.Circulation,2004,109(12):1543-1549.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.06.199

2014-12-02]

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