胸腔積液酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值

崔　丹，趙　杰，馮秀莉，李志惠(河北省胸科醫(yī)院結(jié)核一科，河北 石家莊 050041)

?

·論著·

胸腔積液酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值

崔丹，趙杰，馮秀莉，李志惠*(河北省胸科醫(yī)院結(jié)核一科，河北 石家莊 050041)

[摘要]目的探討胸腔積液酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)診斷結(jié)核性胸膜炎的臨床價值。方法將收治的胸腔積液患者163例分為結(jié)核性胸膜炎組(結(jié)核組)103例和非結(jié)核性胸膜炎組(對照組)60例。對所有胸腔積液患者進(jìn)行ELISPOT、腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)檢測。結(jié)果結(jié)核性胸腔積液中ELISPOT及ADA水平顯著高于非結(jié)核性胸腔積液(P<0.01)。ELISPOT診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度(92.2%)，高于ADA的敏感度(81.6%)。ELISPOT診斷結(jié)核性胸膜炎的特異度(93.3%)，與ADA的特異度(91.7%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論ELISPOT診斷結(jié)核性胸膜炎敏感度高，同時具有很好的特異度，可作為診斷結(jié)核性胸膜炎的重要參考指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核，胸膜；胸腔積液；酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.005

結(jié)核性胸膜炎是胸膜由結(jié)核分枝桿菌侵犯及機(jī)體對結(jié)核蛋白成分過敏狀態(tài)的胸膜炎癥，是臨床常見的肺外結(jié)核病。傳統(tǒng)診斷結(jié)核性胸膜炎的方法如結(jié)核菌培養(yǎng)及胸水抗酸染色陽性率極低，胸腔積液腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)檢測是目前診斷結(jié)核性胸膜炎常用的且較為準(zhǔn)確的指標(biāo)之一，但其敏感度較低；故目前結(jié)核性胸膜炎的診斷依然還需要通過病史、影像學(xué)和療效觀察等一系列臨床表現(xiàn)，尚缺乏敏感度及特異度較高的指標(biāo)。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)是通過檢測外周血及體液中結(jié)核特異性釋放γ干擾素水平(interferon-γ,IFN-γ)來檢測結(jié)核感染的方法，因其敏感度及特異度高[1]，在發(fā)達(dá)國家廣泛應(yīng)用。由于結(jié)核感染具有隔室化效應(yīng)[2]，即抗原特異性T細(xì)胞向病變部位集中，故結(jié)核性胸膜炎胸腔積液的ELISPOT有可能較外周血具有更高的診斷價值[3-4]。本研究通過ELISPOT方法檢測103例結(jié)核性及60例非結(jié)核性胸腔積液的IFN-γ水平，探討胸腔積液ELISPOT對結(jié)核性胸膜炎的診斷意義。現(xiàn)報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2011年12月—2013年12月我科收治的胸腔積液患者(剔除診斷不明確及無病理、細(xì)菌學(xué)相關(guān)證據(jù)臨床診斷的結(jié)核性胸膜炎)163例。結(jié)核性胸膜炎患者(結(jié)核組)103例，男性53例，女性50例，年齡19～69歲，平均(45±16)歲；其中胸腔積液抗酸染色陽性43例，羅氏培養(yǎng)結(jié)果陽性36例，胸膜組織活檢病理明確診斷24例。非結(jié)核性胸膜炎患者(對照組)60例，男性34例，女性26例，年齡21～69歲，平均(51±17)歲；其中腫瘤性胸腔積液47例，原發(fā)胸膜惡性病變7例，肺炎旁積液6例。腫瘤病理均經(jīng)過病理細(xì)胞學(xué)證實(shí)，其他疾病經(jīng)常規(guī)檢驗(yàn)、影像學(xué)及療效等證實(shí)。所有入選病例均無均艾滋病，病毒抗體陰性，無合并糖尿病及風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病，無嚴(yán)重心、肝、腎功能不全。

1.2方法

1.2.1ELISPOT采用英國Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的T-Spot-TB試劑盒，于治療前取新鮮胸腔積液100 mL立即進(jìn)行檢測(樣本采集后2 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，4 h內(nèi)完成檢測)。胸腔積液分離得到胸水單個核細(xì)胞并制備成濃度為2.0×106/mL的細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對照，植物血凝素(phytohae magglutinin,PHA)作為陽性對照，結(jié)核菌特異性抗原早期分泌抗原靶6(early secretory antigen 6，ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(culture fitrate protein,CFP-10)作為刺激抗原。每孔加入含2.5×105個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，將微孔板放在含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h，第2天洗板后加入生物素標(biāo)記的二抗，2～8 ℃反應(yīng)1 h，洗板后加入顯色底物液，室溫靜置7 min，去離子水終止反應(yīng)。通過細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)系統(tǒng)記錄斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)空白對照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)<6時任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，結(jié)果即為陽性；若空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍空白孔斑點(diǎn)數(shù)結(jié)果即為陽性。否則為陰性。

1.2.2ADA檢測取新鮮胸腔積液10 mL，以1 000 r/min離心5 min，取上清液用酶法測定ADA活性，參照試劑盒說明進(jìn)行診斷，ADA≥45 U/L定義為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ELISPOT和ADA檢測陽性率比較結(jié)核組胸腔積液中ELISPOT和ADA檢測水平顯著高于對照組(P<0.01)，見表1。

表1　2組胸腔積液ELISPOT和ADA檢測水平比較

2.2ELISPOT和ADA檢測的敏感度和特異度ELISPOT的敏感度92.2%(95/103)、特異度93.3%(56/60)，高于ADA檢測的敏感度81.6%(84/103)、特異度91.7%(55/60)。

2.3ROC曲線分析胸腔積液ADA 活性和ELISPOT的ROC曲線下面積分別為0.913(95%CI為0.891～0.970)和0.901(95%CI為0.832～0.960)。ADA的最優(yōu)截斷點(diǎn)為42.581 U/L；胸腔積液ELISPOT的SFC數(shù)≥176/106胸水單個核細(xì)胞為診斷界值，可獲得相對較高的診斷敏感度及特異度。

3討論

胸腔積液的鑒別一直是臨床診斷的一個難點(diǎn)，其中結(jié)核性胸膜炎占胸膜疾病的49.6%，且發(fā)病呈逐年上升趨勢[5]。結(jié)核性胸膜炎的診斷金標(biāo)準(zhǔn)是胸水中找到或培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌，但因陽性率低[6]；胸膜活檢雖然特異度較高，但其創(chuàng)傷較大限制了其廣泛應(yīng)用。由于現(xiàn)有方法診斷結(jié)核性胸膜炎的局限性，迫切需要一種快速、敏感的診斷技術(shù)來提高結(jié)核性胸膜炎的診斷效率。

ELISPOT是檢測細(xì)胞免疫功能的方法，已廣泛應(yīng)用到結(jié)核分枝桿菌感染的快速診斷中[7]。當(dāng)機(jī)體感染結(jié)核后產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞，經(jīng)外源性特異抗原刺激后可產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞。T-Spot-TB是利用結(jié)核特異抗原ESAT-6、CFP-10，通過ELISPOT檢測受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷目前是否感染結(jié)核桿菌的新方法。

目前外周血單個核細(xì)胞結(jié)核菌特異性IFN-γ的ELISPOT已廣泛應(yīng)用于結(jié)核感染的診斷，但由于外周血ELISPOT不能區(qū)分潛伏和活動性結(jié)核病，導(dǎo)致診斷特異度受限[8]。結(jié)核感染局部有隔室化效應(yīng)，直接來源于胸膜腔的胸液局部細(xì)胞數(shù)量顯著高于外周血。有文獻(xiàn)報道結(jié)核性胸膜炎患者胸腔中效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量較外周血高10～15倍[9]。Wilkinson等[10]研究證實(shí)胸腔積液的ELISPOT對結(jié)核性胸膜炎的診斷效能遠(yuǎn)大于外周血。ADA是人體嘌呤核苷代謝中的一種酶,廣泛存在于全身各組織器官中，其中淋巴細(xì)胞特別是T 細(xì)胞內(nèi)ADA的含量最高。有資料顯示結(jié)核性胸膜炎時胸腔積液中的ADA 含量明顯增高,主要與T 淋巴細(xì)胞受到抗原刺激后激活、增殖、分化明顯增多有關(guān)[11]。目前認(rèn)為ADA是傳統(tǒng)診斷結(jié)核性胸膜炎的重要指標(biāo)，在很多國家已成為診斷結(jié)核性胸膜炎的常規(guī)檢查項目。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核組胸腔積液中ELISPOT和ADA檢測水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；胸腔積液ADA 活性和ELISPOT的ROC曲線下面積分別為0.913(95%CI為0.891～0.970)和0.901(95%CI為0.832～0.960)，表明胸腔積液的ELISPOT和ADA檢測均可作為診斷結(jié)核性胸膜炎的參考指標(biāo)，胸腔積液ELISPOT的SFC數(shù)≥176/106胸腔積液單個核細(xì)胞為診斷界值，可獲得相對較高的診斷敏感度及特異度。

本研究結(jié)果顯示，ADA檢測與ELISPOT診斷結(jié)核性胸膜炎的特異度相近(91.7%vs93.3%)，但ELISPOT在結(jié)核性胸膜炎早期診斷中具有較胸腔積液ADA檢測更高的敏感度(92.2%vs81.6%)。ELISPOT可作為診斷結(jié)核性胸膜炎的重要輔助診斷指標(biāo)。如果ELISPOT與ADA檢測聯(lián)合則可進(jìn)一步提高結(jié)核性胸膜炎的診斷效率。

由于本研究受到樣本量的限制，故其結(jié)論尚有待進(jìn)一步證實(shí)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Lee SS,Chou KJ,Su IJ,et al.High prevalence of latent tuberculosis infection in patients in end-stage renal disease on hemodialysis:Comparison of QuantiFERON-TB GOLD,ELISPOT,and tuberculin skin test[J].Infection,2009,37(2):96-102.

[2]劉菲，張霞，杜鳳嬌，等.γ干擾素釋放試驗(yàn)檢測胸腔積液對診斷結(jié)核性胸膜炎的初步探討[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2014,37(5):323-327.

[3]Patel VB,Singh R,Connolly C,et al.Cerebrospinal T-cell responses aid in the diagnosis of tuberculous meningitis in a human immunodeficiency virus-and tuberculosis-endemic population[J].Am J Respir Crit Care Med,2010,182(4):569-577.

[4]Jafari C,Ernst M,Kalsdorf B,et al.Rapid diagnosis of smearnegative tuberculosis by bronehoalveolar lavage enzyme-linked immunospot[J].Am J Respir Crit Care Med,2006,174(9):1048-1054.

[5]Trajman A.Pai M,Dheda K,et al.Novel tests for diagnosing tuberculous pleural effusion:what works and what does not？[J].Eur Respir J,2008,31(5):1098-1106.

[6]曹月琴，朱明林，蘇白齡.ADA、IFN-γ在鑒別診斷結(jié)核性和惡性胸腔積液中的價值[J].臨床肺科雜志，2012，17(9)：1666-1667

[7]賈紅彥，蘭汀隆，劉菲，等.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核中的輔助診斷價值[J].北京醫(yī)學(xué)，2012，34(10)：867-870.

[8]劉菲，張宗德，高孟秋，等.不同抗原的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測技術(shù)對結(jié)核病的輔助診斷價值比較[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2009,32(11):838-841.

[9]Pai M,Zwerling A,Menzies D.Systematic review:T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection:an update[J].Ann Intern Med,2008,149(3):177-184.

[10]Wilkinson KA,Wilkinon RJ,Pathan A,et al.Ex vivo characterization of early secretory antigenic target 6-specfic T cells at sites of active disease in pleural tuberculosis[J].Clin Infect Dis,2005,40(1):184-187.

[11]張敦華.實(shí)用胸膜病學(xué)[M].上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1997:120.

(本文編輯：劉斯靜)

Enzyme-linked immunospot assay in diagnosis of tuberculous pleurisy

CUI Dan,ZHAO Jie,FENG Xiu-li,LI Zhi-hui*

(Department of Tuberculosis,Hebei Chest Hospital,Shijiazhuang 050041,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the enzyme-linked immunospot assay(ELISPOT) in the diagnosis of tuberculous pleurisy.MethodsA total of 163 pleural effusion patients admitted to hospital were enrolled.The patients were divided into tuberculous pleurisy group and non tuberculous pleurisy group.The pleural effusion in all patients was detected by ELISPOT and adenosine deaminase(ADA) activity was tested.ResultsELISPOT and ADA activity were significantly higher in tuberculous pleural effusion than non tuberculous pleural effusion(P<0.01).The sensitivity for the tuberculous pleurisy diagnosis by ELISPOT 92.2%,was higher than ADA sensitivity,81.6%.The specificity for the tuberculous pleurisy diagnosis by ELISPOT 93.3%,showed no significant difference as compared with ADA specificity,91.7%.ConclusionELISPOT can be a useful tool in diagnosing tuberculous pleurisy and is specific.

[Key words]tuberculosis,pleural；pleural effusion；enzyme-linked immunospot assay

[中圖分類號]R521.7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)12-1384-03

*通訊作者

[作者簡介]崔丹(1982-)，女，河北任丘人，河北省胸科醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事結(jié)核性疾病診治研究。

[收稿日期]2015-04-15；[修回日期]2015-06-24